Эффективность литиевой соли дисульфида глутатиона и инозина в лечении рассеянного склероза в эксперименте

Полный текст

Введение. Рассеянный склероз (РС) - хрониче- ское нейродегенеративное заболевание централь- ной нервной системы аутоиммунной природы, при котором основными аутоантигенами являются белки миелиновой оболочки нервных волокон [6]. Рассеян- ный склероз встречается с частотой 30 - 70 случаев на 100 тысяч населения [1]. Механизмом, приводящим к повреждению миели- на, является опосредованная Т-лимфоцитами реакция гиперчувствительности замедленного типа, а мишенью активных Т-лимфоцитов - основной белок миелина. Современные подходы к терапии РС, включающие введение рекомбинантных антител, а также других средств, специфически действующих на компоненты иммунной системы, затратны с учетом необходимости длительного лечения. Так как точные причины развития рассеянного склероза неизвестны, пока еще не существует истин- но этиотропного, т. е. устраняющего причины болезни лечения. Однако, учитывая несомненную роль аутоим- мунных процессов в развитии болезни, к средствам этиотропной терапии на современном этапе знаний относят препараты и методы, подавляющие развитие реакций иммунитета [15]. Применение в неврологической практике пре- паратов лития обусловлено установленными нейро- протективными и нейротрофическими эффектами и преимущественной компартментализацией этого микроэлемента в нервной ткани [8]. Эксперименталь- ные подтверждения нейропротективных эффектов лития при ишемии мозга и при нейродегенеративных заболеваниях открывают новые возможности приме- нения литийсодержащих препаратов в клинической неврологии [4, 5, 10]. Наше внимание привлек новый препарат «Лиглу- тин» - литиевая соль дисульфида глутатиона и инозина (LiGSSG-инозин), - характеризующийся целым рядом особенностей биологического действия. Кроме этого, как показали более ранние исследования, LiGSSG- инозин обладает умеренным иммунодепрессивным эффектом, угнетая биосинтез антител и реакцию гиперчувствительности замедленного типа. До настоящего времени не удавалось воспроиз- вести у животных хроническое демиелинизирующее заболевание, полностью сходное с рассеянным склерозом у человека. Однако ряд эксперименталь- ных патологических синдромосходных состояний, подходящих для фармакологических исследований, ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 3 (63) - 2018 137 Экспериментальные исследования все же разработан. Из них наиболее адекватным рас- сеянному склерозу считается экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) [8]. Цель исследования. Изучить возможности фар- макологической коррекции неврологических наруше- ний при ЭАЭ с помощью литиевой соли дисульфида глутатиона и инозина. Материалы и методы. Эксперименты проводили на 24 лабораторных морских свинках обоего пола мас- сой тела 250-300 г и 18 лабораторных кроликах - сам- цах породы шиншилла массой тела 2,5-3 кг. Животные поступали из питомника «Рапполово» (Ленинградская область). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в со- ответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных исследований или в иных научных целях [9], и Руководства по содержанию и использо- ванию лабораторных животных [12]. Всех животных содержали при сходных условиях в отношении тем- пературы, влажности и освещенности. Для воспроизведения ЭАЭ использовали методику De Sarno P. et al. [10]. Раствор основного белка мие- лина (ОБМ) морских свинок фирмы «Sigma» (Соеди- ненные Штаты Америки - США) в объеме 0,1 мл (20 мкг) смешивали с 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда фирмы «Дифко» (США), получая, таким образом, эн- цефалитогенную смесь, которую вводили морским свинкам в подушечку правой задней лапки. Лечение начинали через 7 сут после сенсибилизации, для чего морских свинок распределили на 2 группы по 12 осо- бей в каждой (одна - контрольная, вторая - опытная). Препарат LiGSSG-инозин вводили животным опытной группы внутримышечно через день в разовой дозе 10 мг/кг в течение 35 сут. У кроликов ЭАЭ вызывали введением животным ОБМ кроликов фирмы «Sigma» (США). Для этого 0,2 мл раствора, содержащего 50 мкг ОБМ кроликов, сме- шивали с 0,2 мл полного адъюванта Фрейнда фирмы «Дифко» (США) и вводили в подушечки задних лап кроликов по 0,2 мл. Через 10 сут после сенсибили- зации 9 кроликам начинали вводить LiGSSG-инозин по 10 мг/кг внутримышечно через 1 день (опытная группа); оставшимся 9 кроликам (контрольная груп- па) вводили 0,9% раствор хлорида натрия. Введение LiGSSG-инозина продолжали в течение 30 сут. Живот- ных 1 раз в 3 дня взвешивали в течение всего периода наблюдения. Через 21 сутки после сенсибилизации всем животным было поставлена внутрикожная проба с 20 мкг ОБМ морских свинок и 25 мкг ОБМ кроликов для подтверждения факта развития аутоиммунных процессов. Тяжесть аутоиммунной патологии оценивали ежедневно в соответствии со следующей шкалой: 0 - норма, 1 - потеря тонуса хвоста, 2 - слабость задних лап или их паралич, 3 - сильный паралич конечностей, 4 - полный паралич (неспособность двигаться), 5 - смерть. Полученные данные обрабатывали общепри- нятыми методами вариационной статистики с при- менением пакета прикладных программ Statistica for Windows ver. 6.0 с расчетом среднего значения, ошиб- ки средней и среднего квадратичного отклонения [7]. Количественную оценку выживаемости животных и эффективность применения литиевой соли при ЭАЭ проводили с применением пробит-анализа (по Фин- ни). Сравнение проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Среднюю ошибку альтернативных пока- зателей (приблизительное значение) определяли с помощью таблицы Генеса [3]. Расчет доверительного интервала альтернативных показателей проводили с использованием поправки Йетса для малых выборок и применением вспомогательной переменной Фишера. Результаты и их обсуждение. На пике клини- ческих проявлений у 44% животных степень тяжести состояния соответствовала 3+; у 28,5% - 1+, 2+. Бессимптомное течение болезни наблюдали у 27,5% морских свинок. У животных наблюдали тремор, атаксию, парезы конечностей. Через 1-2 дня у части свинок появились параличи, возникло нарушение функции органов малого таза. Снижение массы тела отмечено с 15 суток после сенсибилизации, у некоторых животных к 21-23-м суткам масса тела снизилась на 30-40% по сравнению с исходной. На 22-23-и сутки морские свинки стали погибать. При сравнительной оценке клинической картины у животных опытной и контроль- ной групп отмечено, что применение LiGSSG-инозина сопровождалось более легким течением ЭАЭ. Прежде всего, особи опытной группы заболели на 2-3 дня позже, чем в контрольной. В контрольной группе на фоне развившейся болезни погибло 8 из 12 живот- ных; в опытной группе заболели только 4 особи, все выжили (табл.). К 30-м сут общее состояние у большинства жи- вотных приближалось к нормальному и клинически его оценивали как «выздоровление». Кожные пробы были положительны у 100% контрольных животных и только у 25% животных опытной группы. Самым ранним признаком начинающегося ЭАЭ было внезапное или постепенное сильное снижение массы тела экспериментальных животных: у кроли- ков - до 500 г, у морских свинок - до 130 г. Через 1-2 дня после этого появились первые неврологические симптомы (парезы конечностей, атаксия). Одним из наиболее постоянных и тяжелых симптомов ЭАЭ явля- ется наличие у подавляющего большинства животных нарушений функции тазовых органов (ослабление сфинктеров прямой кишки и мочевого пузыря с не- держанием кала и мочи). Симптомы ЭАЭ были более выражены у кроликов и в меньшей степени у морских свинок. Полученные данные свидетельствуют о том, что у 100% животных введение ОБМ запускает аутоиммун- ные процессы демиелинизации в нервной системе. Подтверждением этого служат данные, указывающие 138 3 (63) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования Таблица Влияние литиевой соли дисульфида глутатиона и инозина на тяжесть течения и частоту развития клинических проявлений ЭАЭ у морских свинок, % Показатель Группа Наличие симптома Сроки исследования после сенсибилизации, сут Показатель Группа Наличие симптома 20-23 23-25 30 Снижение двигательной активности Контрольная + 58±15 75±13 75±13 Снижение двигательной активности Опытная - 17±11* 33±15* 8±8* Снижение массы тела Контрольная + 100-8 100-8 100-8 Снижение массы тела Опытная - 8±8* 25±13* 17 ±11* Нарушение функции тазовых органов Контрольная + 100-8 83±11 83±11 Нарушение функции тазовых органов Опытная - 8±8* 33±15* 25±13* Тремор Контрольная + 66±15 58±15 50±15 Тремор Опытная - 17±11* 17±11* 17±11* Атаксия Контрольная + 100-8 100-8 100-8 Атаксия Опытная - 8±8* 8±8* 8±8* Парезы конечностей Контрольная + 100-8 100-8 100-8 Парезы конечностей Опытная + 17±11* 17±11* 17±11* Параличи конечностей Контрольная + 66±15 83±11 58±15 Параличи конечностей Опытная - 0+8* 0+8* 0+8* Смерть Контрольная + 75±13 75±13 75±13 Смерть Опытная - 0+8* 0+8* 0+8* Примечание: * - различия по сравнению с контрольной группой, p<0,05. на развитие под влиянием ОБМ экспериментального аллергического энцефаломиелита, эквивалентного по неврологической симптоматике рассеянному склерозу у человека (нарушаются функции тазовых органов, появляется атаксия, развиваются парезы и параличи конечностей). Адекватность разработанной модели ЭАЭ син- дромосходному состоянию РС у человека позволила применить ее в исследованиях на животных по оценке эффективности LiGSSG-инозина в лечении рассеян- ного склероза. Установлено, что лечебное примене- ние лиглутина в течение 30-35 сут с началом терапии через 7-10 сут после сенсибилизации животных предотвращает развитие ЭАЭ у 75% лабораторных животных, у остальных 25% особей ЭАЭ протекает в более легкой форме. При этом гибели животных опытной группы не выявлено. Таким образом, в опы- тах на морских свинках и кроликах при ЭАЭ (модели рассеянного склероза) установлена высокая лечебная эффективность литиевой соли дисульфида глутатиона и инозина. Заметим, что лиглутин, также как и его натриевый аналог моликсан, - двухкомпонентный препарат: он состоит из дисульфида глутатиона и инозина. Наличие пептидной компоненты - дисульфида глутатиона - способствует ингибированию р-гликопротеина [11, 14], повышению проницаемости гематоэнцефали- ческого барьера и накоплению в нейронах головного мозга лития и инозина, который, как известно, обла- дает выраженным нейропротективным и иммуномо- дулирующим эффектами [13]. Ингибирование литием сигнального белка-фермента киназы-3-гликоген синтетазы препятствует гибели нейронов при ишемии и нейродегенерации. Другим важным молекулярным механизмом действия лития является модуляция метаболизма фосфоинозитолов, что оптимизирует активность лизосом и стимулирует аутофагию [2]. Кроме того, повышение концентрации инозина в нейронах головного мозга способствует активации биоэнергетических процессов и ремиелинизации центральной нервной системы [14].

Об авторах

А Е Антушевич

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

А Н Гребенюк

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

В Я Апчел

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

В В Кацалуха

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

А Е Коровин

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

Н В Цыган

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Гатчина

А Г Климов

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Санкт-Петербург

Б Л Гаврилюк

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы