Efficiency of lithium salt of disulphide of glutathione and inosine in treatment of multiple sclerosis in experiment

Abstract


We studied the possibility of pharmacological correction of neurological disorders in guinea pigs and rabbits with the lithium salt of disulphide of glutathione and inosine medication in experimental allergic encephalomyelitis caused by inoculation of the main myelin protein in Freund’s complete adjuvant. The intradermal test with the main protein of myelin was accomplished in all animals to confirm the autoimmune process at 21st day after sensibilization. The lithium salt of disulphide of glutathione and inosine medication was administered intramuscularly every other day at a single dose of 10 mg/kg for 5 weeks. The symptoms of experimental allergic encephalomyelitis were more pronounced in rabbits and to a lesser extent in guinea pigs. The high therapeutic efficacy of lithium salt of disulphide of glutathione and inosine was established according to the severity and incidence of neurological disorders (dysfunction of the pelvic organs, ataxia, tremor, paralysis and paresis of the limbs) and lethality rate. Early (at 5 days after sensibilization) and subsequent therapeutic use of lithium salt of disulphide of glutathione and inosine prevented the development of experimental allergic encephalomyelitis in 75% of laboratory animals, in the rest 25% of the animals the course of experimental allergic encephalomyelitis was comparatively mild. There were no lethal outcomes in study group compared with lethal outcomes in 70% of animals in control group. Experimental evidence of neuroprotective effects of lithium in brain ischemia and in neurodegenerative diseases highlights new opportunities for the use of lithium-containing drugs in clinical neurology. It has been confirmed that the lithium salt of glutathione and inosine disulfide has a moderate immunosuppressive effect, inhibiting the biosynthesis of antibodies and the delayed-type hypersensitivity reaction.

Введение. Рассеянный склероз (РС) - хрониче- ское нейродегенеративное заболевание централь- ной нервной системы аутоиммунной природы, при котором основными аутоантигенами являются белки миелиновой оболочки нервных волокон [6]. Рассеян- ный склероз встречается с частотой 30 - 70 случаев на 100 тысяч населения [1]. Механизмом, приводящим к повреждению миели- на, является опосредованная Т-лимфоцитами реакция гиперчувствительности замедленного типа, а мишенью активных Т-лимфоцитов - основной белок миелина. Современные подходы к терапии РС, включающие введение рекомбинантных антител, а также других средств, специфически действующих на компоненты иммунной системы, затратны с учетом необходимости длительного лечения. Так как точные причины развития рассеянного склероза неизвестны, пока еще не существует истин- но этиотропного, т. е. устраняющего причины болезни лечения. Однако, учитывая несомненную роль аутоим- мунных процессов в развитии болезни, к средствам этиотропной терапии на современном этапе знаний относят препараты и методы, подавляющие развитие реакций иммунитета [15]. Применение в неврологической практике пре- паратов лития обусловлено установленными нейро- протективными и нейротрофическими эффектами и преимущественной компартментализацией этого микроэлемента в нервной ткани [8]. Эксперименталь- ные подтверждения нейропротективных эффектов лития при ишемии мозга и при нейродегенеративных заболеваниях открывают новые возможности приме- нения литийсодержащих препаратов в клинической неврологии [4, 5, 10]. Наше внимание привлек новый препарат «Лиглу- тин» - литиевая соль дисульфида глутатиона и инозина (LiGSSG-инозин), - характеризующийся целым рядом особенностей биологического действия. Кроме этого, как показали более ранние исследования, LiGSSG- инозин обладает умеренным иммунодепрессивным эффектом, угнетая биосинтез антител и реакцию гиперчувствительности замедленного типа. До настоящего времени не удавалось воспроиз- вести у животных хроническое демиелинизирующее заболевание, полностью сходное с рассеянным склерозом у человека. Однако ряд эксперименталь- ных патологических синдромосходных состояний, подходящих для фармакологических исследований, ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 3 (63) - 2018 137 Экспериментальные исследования все же разработан. Из них наиболее адекватным рас- сеянному склерозу считается экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) [8]. Цель исследования. Изучить возможности фар- макологической коррекции неврологических наруше- ний при ЭАЭ с помощью литиевой соли дисульфида глутатиона и инозина. Материалы и методы. Эксперименты проводили на 24 лабораторных морских свинках обоего пола мас- сой тела 250-300 г и 18 лабораторных кроликах - сам- цах породы шиншилла массой тела 2,5-3 кг. Животные поступали из питомника «Рапполово» (Ленинградская область). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в со- ответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных исследований или в иных научных целях [9], и Руководства по содержанию и использо- ванию лабораторных животных [12]. Всех животных содержали при сходных условиях в отношении тем- пературы, влажности и освещенности. Для воспроизведения ЭАЭ использовали методику De Sarno P. et al. [10]. Раствор основного белка мие- лина (ОБМ) морских свинок фирмы «Sigma» (Соеди- ненные Штаты Америки - США) в объеме 0,1 мл (20 мкг) смешивали с 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда фирмы «Дифко» (США), получая, таким образом, эн- цефалитогенную смесь, которую вводили морским свинкам в подушечку правой задней лапки. Лечение начинали через 7 сут после сенсибилизации, для чего морских свинок распределили на 2 группы по 12 осо- бей в каждой (одна - контрольная, вторая - опытная). Препарат LiGSSG-инозин вводили животным опытной группы внутримышечно через день в разовой дозе 10 мг/кг в течение 35 сут. У кроликов ЭАЭ вызывали введением животным ОБМ кроликов фирмы «Sigma» (США). Для этого 0,2 мл раствора, содержащего 50 мкг ОБМ кроликов, сме- шивали с 0,2 мл полного адъюванта Фрейнда фирмы «Дифко» (США) и вводили в подушечки задних лап кроликов по 0,2 мл. Через 10 сут после сенсибили- зации 9 кроликам начинали вводить LiGSSG-инозин по 10 мг/кг внутримышечно через 1 день (опытная группа); оставшимся 9 кроликам (контрольная груп- па) вводили 0,9% раствор хлорида натрия. Введение LiGSSG-инозина продолжали в течение 30 сут. Живот- ных 1 раз в 3 дня взвешивали в течение всего периода наблюдения. Через 21 сутки после сенсибилизации всем животным было поставлена внутрикожная проба с 20 мкг ОБМ морских свинок и 25 мкг ОБМ кроликов для подтверждения факта развития аутоиммунных процессов. Тяжесть аутоиммунной патологии оценивали ежедневно в соответствии со следующей шкалой: 0 - норма, 1 - потеря тонуса хвоста, 2 - слабость задних лап или их паралич, 3 - сильный паралич конечностей, 4 - полный паралич (неспособность двигаться), 5 - смерть. Полученные данные обрабатывали общепри- нятыми методами вариационной статистики с при- менением пакета прикладных программ Statistica for Windows ver. 6.0 с расчетом среднего значения, ошиб- ки средней и среднего квадратичного отклонения [7]. Количественную оценку выживаемости животных и эффективность применения литиевой соли при ЭАЭ проводили с применением пробит-анализа (по Фин- ни). Сравнение проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Среднюю ошибку альтернативных пока- зателей (приблизительное значение) определяли с помощью таблицы Генеса [3]. Расчет доверительного интервала альтернативных показателей проводили с использованием поправки Йетса для малых выборок и применением вспомогательной переменной Фишера. Результаты и их обсуждение. На пике клини- ческих проявлений у 44% животных степень тяжести состояния соответствовала 3+; у 28,5% - 1+, 2+. Бессимптомное течение болезни наблюдали у 27,5% морских свинок. У животных наблюдали тремор, атаксию, парезы конечностей. Через 1-2 дня у части свинок появились параличи, возникло нарушение функции органов малого таза. Снижение массы тела отмечено с 15 суток после сенсибилизации, у некоторых животных к 21-23-м суткам масса тела снизилась на 30-40% по сравнению с исходной. На 22-23-и сутки морские свинки стали погибать. При сравнительной оценке клинической картины у животных опытной и контроль- ной групп отмечено, что применение LiGSSG-инозина сопровождалось более легким течением ЭАЭ. Прежде всего, особи опытной группы заболели на 2-3 дня позже, чем в контрольной. В контрольной группе на фоне развившейся болезни погибло 8 из 12 живот- ных; в опытной группе заболели только 4 особи, все выжили (табл.). К 30-м сут общее состояние у большинства жи- вотных приближалось к нормальному и клинически его оценивали как «выздоровление». Кожные пробы были положительны у 100% контрольных животных и только у 25% животных опытной группы. Самым ранним признаком начинающегося ЭАЭ было внезапное или постепенное сильное снижение массы тела экспериментальных животных: у кроли- ков - до 500 г, у морских свинок - до 130 г. Через 1-2 дня после этого появились первые неврологические симптомы (парезы конечностей, атаксия). Одним из наиболее постоянных и тяжелых симптомов ЭАЭ явля- ется наличие у подавляющего большинства животных нарушений функции тазовых органов (ослабление сфинктеров прямой кишки и мочевого пузыря с не- держанием кала и мочи). Симптомы ЭАЭ были более выражены у кроликов и в меньшей степени у морских свинок. Полученные данные свидетельствуют о том, что у 100% животных введение ОБМ запускает аутоиммун- ные процессы демиелинизации в нервной системе. Подтверждением этого служат данные, указывающие 138 3 (63) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования Таблица Влияние литиевой соли дисульфида глутатиона и инозина на тяжесть течения и частоту развития клинических проявлений ЭАЭ у морских свинок, % Показатель Группа Наличие симптома Сроки исследования после сенсибилизации, сут Показатель Группа Наличие симптома 20-23 23-25 30 Снижение двигательной активности Контрольная + 58±15 75±13 75±13 Снижение двигательной активности Опытная - 17±11* 33±15* 8±8* Снижение массы тела Контрольная + 100-8 100-8 100-8 Снижение массы тела Опытная - 8±8* 25±13* 17 ±11* Нарушение функции тазовых органов Контрольная + 100-8 83±11 83±11 Нарушение функции тазовых органов Опытная - 8±8* 33±15* 25±13* Тремор Контрольная + 66±15 58±15 50±15 Тремор Опытная - 17±11* 17±11* 17±11* Атаксия Контрольная + 100-8 100-8 100-8 Атаксия Опытная - 8±8* 8±8* 8±8* Парезы конечностей Контрольная + 100-8 100-8 100-8 Парезы конечностей Опытная + 17±11* 17±11* 17±11* Параличи конечностей Контрольная + 66±15 83±11 58±15 Параличи конечностей Опытная - 0+8* 0+8* 0+8* Смерть Контрольная + 75±13 75±13 75±13 Смерть Опытная - 0+8* 0+8* 0+8* Примечание: * - различия по сравнению с контрольной группой, p<0,05. на развитие под влиянием ОБМ экспериментального аллергического энцефаломиелита, эквивалентного по неврологической симптоматике рассеянному склерозу у человека (нарушаются функции тазовых органов, появляется атаксия, развиваются парезы и параличи конечностей). Адекватность разработанной модели ЭАЭ син- дромосходному состоянию РС у человека позволила применить ее в исследованиях на животных по оценке эффективности LiGSSG-инозина в лечении рассеян- ного склероза. Установлено, что лечебное примене- ние лиглутина в течение 30-35 сут с началом терапии через 7-10 сут после сенсибилизации животных предотвращает развитие ЭАЭ у 75% лабораторных животных, у остальных 25% особей ЭАЭ протекает в более легкой форме. При этом гибели животных опытной группы не выявлено. Таким образом, в опы- тах на морских свинках и кроликах при ЭАЭ (модели рассеянного склероза) установлена высокая лечебная эффективность литиевой соли дисульфида глутатиона и инозина. Заметим, что лиглутин, также как и его натриевый аналог моликсан, - двухкомпонентный препарат: он состоит из дисульфида глутатиона и инозина. Наличие пептидной компоненты - дисульфида глутатиона - способствует ингибированию р-гликопротеина [11, 14], повышению проницаемости гематоэнцефали- ческого барьера и накоплению в нейронах головного мозга лития и инозина, который, как известно, обла- дает выраженным нейропротективным и иммуномо- дулирующим эффектами [13]. Ингибирование литием сигнального белка-фермента киназы-3-гликоген синтетазы препятствует гибели нейронов при ишемии и нейродегенерации. Другим важным молекулярным механизмом действия лития является модуляция метаболизма фосфоинозитолов, что оптимизирует активность лизосом и стимулирует аутофагию [2]. Кроме того, повышение концентрации инозина в нейронах головного мозга способствует активации биоэнергетических процессов и ремиелинизации центральной нервной системы [14].

A E Antushevich

Email: vmeda-nio@mil.ru

A N Grebenyuk

Email: vmeda-nio@mil.ru

V Ya Apchel

Email: vmeda-nio@mil.ru

V V Katsaluha

Email: vmeda-nio@mil.ru

A E Korovin

Email: vmeda-nio@mil.ru

N V Tsygan

Email: vmeda-nio@mil.ru

A G Klimov

B L Gavrilyuk

Email: vmeda-nio@mil.ru

  1. Бисага, Г.Н. Применение мезенхимальных стволовых клеток при атрофии зрительных нервов у больных рассеянным склерозом: пилотное исследование / Г.Н. Бисага [и др.] // Анналы клин. и эксперимент. неврологии. - 2017. - Т. 11, № 2. - С. 26-31.
  2. Богуш, Т.А. Глутоксим как ингибитор фенотипа множествен- ной лекарственной резистентности, ассоциированной с экспрессией Рgp / Т.А. Богуш [и др.] // Антибиотики и химиотерапия. - 2010. - Т. 55, № 5-6. - С. 18-23.
  3. Генес, В.С. Таблицы достоверных различий между группами наблюдений по качественным показателям / В.С. Генес. - М.: Медицина, 1964. - 80 с.
  4. Громова, О.А. Литийсодержащее средство для профилакти- ки и лечения цереброваскулярных заболеваний и способ применения данного средства: патент на изобретение № 2367427 / О.А. Громова [и др.] // Офиц. бюл. Федер. службы по интеллектуал. собственности. - 2009. - № 26. - С. 1-10.
  5. Зангиева, З.К. Содержание микроэлементов в нервной ткани и ишемический инсульт / З.К. Зангиева [и др.] // Журн. не- врологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2013. - Т. 113, № 3, вып. 2. - С. 30-36.
  6. Завалишин, И.А. Рассеянный склероз: от представлений о патогенезе к лечению / И.А. Завалишин, З.А. Суслина // Невролог. вестн. - 2010. - Т. XLII, вып. 1. - С. 6-8.
  7. Платонов, А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы / А.Е. Платонов. - М.: РАМН, 2000. - 52 с. ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 3 (63) - 2018
  8. Хохлов, А.П. Миелинопатии и демиелинизирующие забо- левания / А.П. Хохлов, Ю.Н. Савченко. - М.: Медицина, 1990. - 208 с.
  9. Council of Europe. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. - 1986. - 48 p.
  10. De Sarno, P. Lithium prevents and ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis / P. De Sarno [et al.] // J. Immunol. - 2008. - Vol. 181, N 1. - Р. 338-345.
  11. Dwivedi, T. Lithium-induced neuroprotection is associated with epigenetic modification of specific BDNF gene promoter and altered expression of apoptotic-regulatory proteins / T. Dwivedi, H. Zhang // Front. Neurosci. - 2015. - Vol. 8, Art. 457. - P. 1-8.
  12. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. - Washington D.C.: The National Academies Press, 2011. - 220 p.
  13. Haskó, G. Immunomodulatory and neuroprotective effect of inosine / G. Haskó, M.V. Sitkovsky, C. Szabó // Trends Pharmacol. Sci. - 2004. - Vol. 25, № 3. - Р. 152-157.
  14. Ragan, C.I. The dephosphorylation of inositol 1,4-bisphosphate to inositol in liver and brain involves two distinct Li+-ensitive enzymes and proceeds via inositol 4-phosphate / C.I. Ragan [et al.] // Biochem. J. - 1988. - Vol. 249, № 1. - Р. 143-148.
  15. Ransohoff, R.M. Multiple sclerosis - a quiet revolution / R.M. Ransohoff [et al.] // Nat. Rev. Neurology. - 2015. - Vol. 11, № 3. - Р. 134-142.

Views

Abstract - 6

PDF (Russian) - 1

Cited-By



Copyright (c) 2018 Antushevich A.E., Grebenyuk A.N., Apchel V.Y., Katsaluha V.V., Korovin A.E., Tsygan N.V., Klimov A.G., Gavrilyuk B.L.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies