Experimental model of oxidative stress in chronic disruption of free radical balance in the biological system: polymyositis of the Wagner-Unverricht form

Full Text

Введение. Экспериментальное моделирование патологий человека на животных имеет большое значение для медицины, в частности для изучения патогенеза заболеваний со свободнорадикальной природой. Основной причиной таких заболеваний является нарушение баланса между антиоксидантной системой (АОС) и её антагонистом - оксидативной системой (ОС) организма [2, 3]. Патологические со- стояния возникают, когда концентрация радикалов во внутренней среде биосистемы и плотность потока активных частиц на наружную поверхность клеточных мембран заметно меняются в сторону увеличения [3]. Если биосистема поддерживает баланс, концентрация активных частиц (свободных радикалов, особенно ак- тивных форм кислорода) во внутренней жидкой среде мало изменяется. При этом плотность диффузионного потока супероксида стабилизирована вблизи по- верхности клеточных мембран на физиологическом уровне концентрации (0,096-0,098 мкмоль/л), что обеспечивает модуляцию потенциалов на поверхно- сти клеток и функцию триггера для эффекторов, на- пример, передачу импульсов Р-клеткам проводящей системы сердца, обеспечивающим автоматический режим сокращений и «спонтанную» [10] диастоличе- скую деполяризацию. Главными составляющими ОС хордовых живот- ных и человека являются гем, частично окисля- ющийся в гемин с образованием супероксида, и побочный продукт его синтеза - копропорфирин III (копропорфирин). Структурной основой этих со- единений является тетрапирол, поэтому в аэроб- ных условиях оба вещества способны принимать электрон, генерируя анион-радикалы кислорода, активные частицы которого вызывают в биосисте- ме цепные радикальные реакции [13] окисления тканевых субстратов с образованием органических перекисей липидов и возрастанием риска повреж- дений клеточных мембран в зоне гемомикроцирку- ляторного русла. Предложенная нами [4] диффузионная модель взаимодействия потока свободных радикалов с актив- ными центрами внешней поверхности клеточной мем- браны позволяет сделать вывод о том, что основная причина патологических состояний свободноради- кальной природы состоит в нарушении баланса между ОС и АОС организма [3, 10], между оксидантами (ра- ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 117 Экспериментальные исследования дикалами) и антиоксидантами. В состоянии баланса диффузионный поток анион-радикалов кислорода из жидкостей организма на клеточную мембрану явля- ется нормальным процессом и представляет один из механизмов нейрогуморальной регуляции, который в широких пределах модулирует вектор поляризации (дипольный момент P) клеточной мембраны, вплоть до изменения его направления, создавая тем самым токи смещения, направленные перпендикулярно по- верхности мембраны. При этом нейрогуморальное воздействие на поверхность клетки осуществляется не только через движение ионов, но также и электро- магнитным полем. Одна из возможных схем распределения за- рядов в активном центре представлена на рисунке [11, 14]. Рассматриваемая здесь модель активного центра состоит из отрицательно заряженного ядра (молекула интегрированного белка), заряд которого скомпенсирован поверхностными аквакомплексами ионов Na+ и K+ (Na×6H O и K×4H O) на внешней и Рис. Электрическая структура активного центра клеточной мембраны большую поверхность клеточной мембраны, син- хронизируя изменение поляризации в отдельных центрах. По достижении критического значения концентрации формируется так называемый по- тенциал действия - электромагнитный импульс со- литонного типа, магнитная составляющая которого производится изменяющимся во времени вектором 2 2 внутренней поверхности мембраны соответственно. электрической индукции (rotH=d/ dt(D), Н -напряжен- Дипольный момент P рассматриваемой структу- ры формируется как сумма дипольного момента интегрированного белка и дипольных моментов, создаваемых зарядами адсорбированных ионов. При этом комплексы ионов Na+ усиливают поляри- зацию мембраны, тогда как комплексы K+ оказывают обратное действие. Суммарный заряд структуры следует считать с учетом частичной ковалентности адсорбированных ионов, эффективный заряд которых составляет в среднем (0,7÷0,8)е (е=1,6∙10-19 Кл - заряд электрона). Полагая отношение ионной плотности совокупности аквакомплексов внешнего и внутреннего кластеров клеточной мембраны по количеству противоионов (рисунок) Na+/K+=6/4, получим для отрицательного за- ряда молекулы интегрированного белка qбелка=[NNa(1- KNa)+NK(1-KK)]e, где NNa, NK - ионные плотности (числа ионов), а KNa, KK - относительные степени ковалентности для натрия и калия соответственно. В идеальном случае (баланс соответствующих ионов) это дает q =N [(1-K )+2/ (1-K )]e. ность магнитного поля) и распространяется между поверхностями мембраны, усиливая эффект син- хронизации. Определенный вклад в поляризацию мембраны вносят нарушения кристаллической структуры били- пидного слоя, имеющие отрицательный поверхност- ный заряд, на которых также формируются подвижные аквакомплексы ионов Na+ и K+. С учетом достаточно высокой энтропии жидкокристаллических структур общая площадь таких участков, по современным пред- ставлениям [1], оценивается в 20% от общей площади наружной клеточной мембраны. В условиях высоких значений напряженности электрического поля на мембране (около 107В/м) становятся возможными ре- акции супероксида с образованием не только оксидов, но пероксидов и супероксидов щелочных металлов, что приводит в конечном итоге к перекисному окис- лению липидов и их «прогоранию» с образованием микроперфораций [3, 8, 10] в наружной мембране, по- этому взаимодействие потока радикалов с подобного рода формированиями на мембране происходит в 3 K Напряженность электрического поля Е в клеточной мембране, усредненное по поверхности значе- ние которой составляет E=U /h, примерно Е=107В/м (U0=80мВ - разность потенциалов на мембране в состоянии покоя; h=8нм - толщина мембраны), представляет собой самосогласованное поле, вклад в которое вносит каждый активный центр поверхно- сти клетки. Поэтому, говоря о токе смещения, плот- ность которого j =d/ (D) равна скорости изменения вектора электрической индукции (вектор индукции D=ε E+P, ε =8,85∙10-12Ф/м - диэлектрическая постоосновном необратимо, в отличие от активных центров (см. рис.), где нейтрализация супероксидом противо- ионов внешнего слоя мембраны неизбежно приводит к конформации белковой молекулы и включению Na- и K-насосов. Процессы взаимодействия потока радикалов с белковыми активными центрами адсорбции ка- тионов, как правило, обратимы. Нейтрализация внешнего противоиона супероксидом обеспечивает нейтральному атому натрия свободный от влияния электрического поля активного центра проход через 0 0 янная), следует учитывать, что при малых интенсивностях потока радикалов происходит в основном локальная деполяризация (за счет модуляции век- тора Р), при большой интенсивности потока, когда наблюдается изменение самосогласованного поля Е, ток смещения распространяется на достаточно мембрану, осуществляя тем самым одноэлектронный перенос во внутреннее пространство клетки. Пере- несенный через мембрану электрон совместно с импульсным электромагнитным полем стимулирует активный процесс, реализуемый Na- и K-насосами, а также молекулами АТФ, обеспечивая тем самым 118 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования энергозатратную составляющую термодинамиче- ского цикла обратимого переноса электрона [16] и работу ионных насосов мембран внутриклеточных органоидов, регулировку антиоксидантной активно- сти в митохондриях для поддержания баланса ОС и АОС [3, 13, 15], иными словами - баланса свободных радикалов в биосистеме. К заболеваниям, природа патогенеза которых тесно связана с повышением во внутренней среде организма концентрации супероксида и конечных радикалов цепных реакций одноэлектронного пере- носа, относятся многие социально значимые заболе- вания человека [6], а также радиационные поражения. Возраст, масса тела, степень половой зрелости и генетическая конституция подопытных животных [2, 5, 6] заметно влияют на развитие патогенеза, обу- словленного диффузионным потоком отрицательно заряженных частиц свободных радикалов кислорода на клеточную поверхность из внутренней среды био- системы. Нейрополимиозит возникает у человека в разном возрасте и часто характеризуется быстрой генера- лизацией патологического процесса, в частности при форме Вагнера-Унферрихта [2, 5]. При этом, помимо мышечных и неврологических синдромов, у больных в 75% случаев имеются признаки поражения внутренних органов, иногда со значительными изме- нениями со стороны сердца [5]. Основными предпо- сылками нарушения баланса ОС и АОС в организме с последующим возникновением нейрополимиозита считают охлаждение, травмы, переутомление и сопут- ствующие инфекции, что сопровождается усилением окислительного стресса во внутренней среде и на клеточной поверхности сосудов, волокон, органов и различных тканей, омываемых жидкостями - произ- водными железосодержащей крови. Цель исследования. Проанализировать длитель- ное нарушение равновесия между ОС и АОС в экс- перименте у животных с искусственным изменением баланса свободных радикалов во внутренней среде организма. Материалы и методы. В экспериментах на линей- ных мышах генерация супероксида и семихинонного радикалов (семихинона) осуществлялась in vivo с по- мощью перорального введения животным ингибитора фермента NAD(P)H (дегидрогеназы) и 1% раствора гидрохинона [2, 5, 6]. Семихинон определяли в плазме крови путем прямого детектирования на спектроме- тре электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) «BER418» фирмы «Bruker» (Федеративная Республика Германии), а аддукты конечного гидроксильного ра- дикала (PBN-OH) - методом спиновых ловушек [6] с использованием N-трет-бутил-альфа-фенил нитрона (PBN) - соединения, которое связывает гидрок- сильные радикалы и позволяет их регистрировать в биологических жидкостях, используя ЭПР. Введение индукторов свободных радикалов подопытным живот- ным при моделировании полимиозита производили один раз в сутки на протяжении от нескольких дней в группе «легких» мышей (начальная масса тела 17,5 г) до нескольких месяцев в группе «тяжелых» (начальная масса тела 24,5 г). Единовременно вводимая per os с помощью зонда доза гидрохинона составляла 0,025 мг/г при общем объеме водных растворов 0,2 мл/ особь. Для эксперимента по моделированию полимио- зита было использовано 28 самцов мышей линии DBA/2. Из них группа «легких» самцов составила 18 особей, «тяжелых» - 10. С учетом предварительных опытов общее количество подопытных животных при разработке модели полимиозита составило около 150. По завершении эксперимента проводились па- томорфологические исследования скелетных мышц и миокарда. Результаты и их обсуждение. Суммарная доза, вызывающая гибель 50% животных (LD50), в группе «лёгких» мышей составила 3 однократных дозы, в группе «тяжелых» мышей - 56 однократных доз. По- смертное гистологическое исследование скелетных мышц «легких» мышей [2, 5] показало, что на 5-е сутки после начала опыта в постоянных препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, а также с помощью серебрения по Кахалю и Фаворскому, ре- гистрируется комплекс некробиотических и воспа- лительных изменений в сочетании с деструктивными и реактивными изменениями мякотных нервных во- локон и их окончаний. Интенсивность сигнала ЭПР семихинона в ис- следованных пробах плазмы крови оказалась на уровне шума (1-е - 4-е сутки опыта) или несколько выше (5-е сутки). Характерный для семихинонного радикала спектр ЭПР с расщеплением 0,24 мТл и соотношением интенсивностей пяти отчетли- во регистрируемых пиков 1:3:5:3:1 (квинтет) в плазме крови после очередного введения рас- творов-индукторов радикалов быстро затухал, но при добавлении к исследуемой пробе раствора гидрохинона становился более явным. Сигнал аддуктов гидроксильного радикала (PBN-OH) в виде триплета дуплетов возникал в пробе плазмы в результате реакции анион-радикалов кислорода с перекисью водорода, проходящей во внутренней среде биосистемы благодаря активности суперок- сиддисмутазы (СОД) [6] и, вероятно, недостаточно высокого уровня активности каталазы. Не менее информативным, чем ЭПР, оказалась методика инфракрасной (ИК) спектроскопии крови подопытных животных [7]. Эксперимент был про- веден отдельно от описанного выше хронического опыта с целью непосредственного наблюдения влияния нарушения баланса радикалов в биосистеме. В ИК-спектрах образцов крови подопытных животных отчетливо наблюдалось появление и релаксация из- быточных свободных радикалов в отношении ампли- туд спектральных линий 3195 см-1 и 1645 см-1, а также их смещения [7, 11]. ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 4 (64) - 2018 119 Экспериментальные исследования Моделирование полимиозита на «легких» мышах позволило проследить развитие патогенеза и кли- ники в зависимости от количества однократных доз введенных индукторов свободных радикалов. После введения третьей - четвертой дозы у мышей можно было наблюдать следующую клиническую картину: от- дельные животные начинали подгибать правую перед- нюю лапку и заваливались вправо. После введения 5-й дозы у выживших мышей этой группы наблюдалось именно такое клиническое проявление болевого эф- фекта, после чего сигнал от гидроксильного радикала в сыворотке крови был самым интенсивным, а без него амплитуда характерного сигнала ЭПР (триплет дуплетов) была существенно ниже. При гистологическом исследовании патоморфо- логические изменения в мышцах передних и задних конечностей у мышей, получивших четыре дозы ин- дукторов радикалов, характеризовались как очаговое истончение и гомогенизация мышечных волокон, но инфильтрация при этом отсутствовала или была умеренной. После введения животным пятой дозы в мышцах наблюдали ослабление нормального по- перечно-полосатого рисунка, очаговую гомогениза- цию с разрушением миоцитов, невриты и выраженную инфильтрацию, иными словами, умеренный и выра- женный миозит. Это наблюдалось также в мышцах у мышей, получивших 6 и 7 доз растворов индукторов радикалов. Микроскопическое изучение срезов двигательных мышц (шеи, спины) мышей из группы с начальной массой тела выше 24 г показало, что картину умерен- ного миозита можно было наблюдать после введения 25-й и 27-й доз индукторов радикалов. У выживших животных (n=3) к этому времени развивалась кахек- сия и формировался горб - клинические признаки токсикоза, которые ко времени введения 54-й и 56-й доз индукторов были резко выражены, но патомор- фологические изменения в мышцах этих мышей при микроскопии с увеличением от 300 до 1000 не наблю- дались (ткани нормальные). Среди «тяжелых» мышей DBA/2 в более ранних опытах с помощью метода электрокардиографии (ЭКГ) были отмечены случаи (1,5-2%) ишемии мио- карда после введения 20 и более доз индукторов радикалов [5]. Вскрытие отдельных животных (n=3) с признаками сердечной недостаточности показало, что передняя или задняя стенка сердца были у них с участком некроза (инфаркт миокарда). В условиях ишемии (по результатам ЭКГ) у одного животного с признаками острой сердечной недостаточности по- сле вскрытия было отмечено наполнение (инъекция) крупного разветвляющегося сосуда стенки миокарда; предынфарктное состояние возникло у животного на пятой неделе хронического опыта после введения 21-й дозы индукторов семихинона и супероксида. Гистологическое изучение повреждений миокарда было проведено при моделировании полимиозита формы Вагнера-Унферрихта на мышах линии C57Bl [5], которые (n=20) получили 27 доз индукторов радикалов. В целом выявленные воспалительно-дистрофические изменения в миокарде имели диффузный характер и отличались тонкой структурой повреждений про- никающего характера. Отдельные мыши ко времени завершения эксперимента передвигались ползком, но лапок не поджимали; ЭКГ и пониженная температура тела животных свидетельствовали о развитии сердеч- ной недостаточности и ишемии миокарда. Диффузное поражение миокарда с микроперфо- рацией оболочек кардиомиоцитов по сути является электрохимическим травлением, основной механизм которого состоит во взаимодействии потока свобод- ных анион-радикалов кислорода из внутренней среды организма с сетью полярных активных центров на поверхности поляризованных жидкокристаллических клеточных мембран [8]. Строение активного цен- тра, ядром которого является заряженная молекула интегрированного белка, позволяет потоку отрица- тельно заряженных радикалов в процессе переноса электрона осуществлять модуляцию вектора поля- ризации активной ячейки, вызывая ток смещения, выражающийся в скачках потенциала [12]. Изменение вектора поляризации (ток смещения) вызывает по- явление импульсов электромагнитного поля, которое, по-видимому, играет ведущую роль в физических механизмах нейрогуморальной регуляции основных процессов, происходящих в биосистеме [5]. Процессы взаимодействия потока радикалов с белковыми активными центрами адсорбции кати- онов, как правило, обратимы. С другой стороны, взаимодействие потока супероксида с дефектными формированиями билипидного слоя происходит в основном необратимо, с образованием пероксидов и супероксидов щелочных металлов, что приводит в конечном итоге к перекисному окислению липидов и их «прогоранию» с образованием микроперфораций [3, 8, 10] в наружной мембране. Защита от окисли- тельного стресса в этом случае обеспечивается анти- оксидантными свойствами самой крови, содержащей билирубин, и «аварийным» гемолизом эритроцитов с неизбежным поступлением в плазму СОД, что на- блюдалось во многих наших экспериментах [2, 5, 6] после введения индукторов радикалов. Сохранение безмякотных нервных волокон у подо- пытных линейных мышей DBA/2 при моделировании нейрополимиозита объясняется тем, что в отсутствие миелина перекисное окисление липидов в мембранах отростков нервных клеток происходит на более низ- ком уровне по сравнению с мякотными волокнами [2]. Изучение динамики патогенеза и развитие клинической картины при моделировании нейро- полимиозита на животных в условиях подавления АОС показывает, что активность ферментов, уча- ствующих в сдерживании цепных реакций с пере- носом электрона свободными радикалами через клеточную мембрану, зависит от возраста, массы тела, степени половой зрелости и индивидуальных, генетически детерминированных особенностей организма линейных мышей. Одноэлектронный 120 4 (64) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования перенос заряда активными частицами свободных радикалов является важнейшей частью баланса между ОС и АОС в тканях, нервных волокнах и органах биосистемы. При нарушении баланса в зонах микроциркуляции жидкостей нарастает па- тогенез. Рост концентрации свободных радикалов в крови приводит к нарушению баланса ОС и АОС и повреждениям. В условиях соблюдения баланса названных систем на физиологическом уровне концентрации радикалов энергоёмкие изменения структуры жидкокристаллической мембраны эффек- торных клеток (астроцитов глии головного мозга, Р-клеток проводящей системы миокарда [9] и др.) реагируют на возрастающий диффузионный поток анион-радикалов из внутренней среды и генерируют электрические потенциалы, распространяющиеся по дипольной сети клеточных липопротеиновых поверхностей в виде электромагнитных полей, обе- спечивая автоматизм органов. Заключение. Одноэлектронный перенос заряда свободными радикалами из внутренней среды на по- верхность клеток является важнейшей частью баланса между ОС и АОС в мышечных тканях, нервных волокнах и других органах биосистемы хордовых животных и человека. При нарушении баланса ОС и АОС в зонах микроциркуляции происходит оксидативный стресс. Именно это и показывает экспериментальная модель нейрополимиозита формы Вагнера-Унферрихта, вос- производимая в хроническом опыте на мышах линии DBA/2 при пероральном введении раствора гидрохи- нона и подавлении активности DT-диафоразы. Диффузионный поток анион-радикалов кислорода на поверхность клеток является постоянным природ- ным фактором внутренней среды хордовых животных и человека, базирующимся на обмене веществ в железосодержащей крови и тканевых жидкостях. В условиях баланса ОС и АОС в моменты повышения или понижения концентрации свободных радикалов на клеточной мембране происходят энергоёмкие изменения её жидкокристаллической структуры, в том числе в астроцитах головного мозга и Р-клетках водителя ритма проводящей системы миокарда. Эффекторы реагируют на изменения поляризации клеточной мембраны и генерируют электромагнитное поле, распространяющееся по дипольной сети по- верхности клеток, обеспечивая автоматизм нейронов и сокращений миокарда. Возникшая в процессе эволюции приспособлен- ность биосистемы к использованию энергии транс- порта электрона свободными радикалами способна ограничивать влияние высокоэнергетических потоков радикалов из крови на рефлекторную деятельность крупных нейронов мозга, защищенных гематоэнцефа- лическим барьером, что позволяет получать управля- ющие сигналы от рецепторов на минимальном уровне электромагнитных помех из внутренней среды. Диффузионный поток радикалов из крови и токи смещения, изменяющие вектор поляризации активных центров клеточных поверхностей, являются фактором внутренней среды, механизмом сигнали- зации, источником энергии и триггером автоматизма процессов в клетках, тканях и органах биосистемы хордовых.

About the authors

M V Listov

Email: m.vmeda-nio@mil.ru

A I Mamykin

References

Supplementary files