Comparative chemical composition analysis of femoral condyles bone tissue in health and in deforming arthrosis

Full Text

Введение. Костная ткань - одна из важнейших тканей организма, обеспечивающая в его жизне- деятельности различные функции [2]. Нарушения функционирования костной ткани проявляются в виде ряда заболеваний. В основе патогенеза мно- гих из них лежит изменение химического состава костей, а следовательно, и изменение в организме в целом обменных процессов. Естественно, что количественные изменения химического состава костной ткани отражаются на физических свойствах кости. Основными химическими компонентами костной ткани являются гидроксиапатит, другие минеральные вещества и органический матрикс. Исследование градиента концентрации гидрокси- апатита и минеральных включений в ячеистой струк- туре кости позволит показать наличие качественных и количественных изменений в неорганическом компоненте трубчатых костей и установить их взаи- мосвязь с имеющимися в них морфологическими преобразованиями [4]. Состав костных тканей человека изучают с помо- щью физико-химических методик, таких как рентге- нофазовый анализ (РФА), рентгенофлюоресцентный анализ, инфракрасная спектрометрия, ядерно-маг- нитный резонанс и т. д. [6, 3]. В настоящее время РФА применяется для исследования костных объектов в палеонтологии и археологии, а также для определения биосовместимости различных имплантов с костью в травматологии и ортопедии [12]. Результаты научных исследований с успехом при- меняются в передовых медицинских исследованиях, например в ортопедии и стоматологии. Изучение дифракционных спектров костей позволяет получить новую и крайне важную информацию о соотношении кальция и фосфора в организме, а также об изме- нениях костного индекса кости с течением жизни организма. Данная информация очень важна в биоме- дицинской инженерии, так как покровные материалы имплантов сильно влияют на межповерхностные вза- имодействия в биологических системах, в частности при имплантации в костную или зубную ткани. Основным минеральным компонентом костной ткани является гидроксиапатит (ГА). Функциональные свойства ГА сильно зависят от его структуры, сте- реометрического соотношения кальция и фосфора, степени кристалличности, а также размеров кри- ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (62) - 2018 177 Экспериментальные исследования сталлических фаз на поверхности и в объёме кости. В настоящее время растет интерес к использованию биоматериалов на основе ГА для восстановления по- вреждённых костей и скелетных дефектов. Проводит- ся ряд исследований, направленных на определение биосовместимости имплантов, имеющих поверхност- ное напыление металлов, с костью [11]. Данные о морфологии костной ткани могут быть получены с помощью различных микроскопических методик. Н.В. Старостенко и др. [5] указывают на то, что кости содержат внутренний трабекулярный слой с 50-90%-ной пористостью, в то время как наружный слой имеет пористость порядка 5-12%. Эти слои сильно отличаются по размеру пор, общей пористости, механическим свойствам и поверхност- ному окружению. Известно, что ГА образует гексогональную кри- сталлическую решётку с пространственной груп- пой P63/M и состоит из 44 атомов в элементарной ячейке [4]. Элементарная ячейка содержит два раз- личных кристаллографических типа ионов кальция, расположенных в цепочку вдоль грани элементар- ной ячейки и вдоль винтовой оси. Столбчатый каль- ций образует параллель с c-осью и располагается приблизительно на середине высоты между двумя ионами кислорода. Кальций, распложенный по винтовой оси, связывает расположенные в центре OH-группы и образует равносторонний треугольник. Данные треугольники ориентированы вдоль оси с в ab плоскости. Размер пластинок ГА составляет око- ло 50 нм в длину, 25 нм в ширину и 3 нм в толщину. В качестве нормального показателя кальцификации кости используют термин «костный индекс» (КИ), в норме имеющий значения 1,8-2,2 у. е. В то же время возможно другое представление степени кристал- личности, такое как соотношение количества атомов кальция к количеству атомов фосфора (10:6). Меди- цинские исследования все чаще сфокусированы на понимании влияния структуры ГА на биохимические свойства поверхности новых медицинских компо- зитных материалов. В исследовании H. Jenssen at al. [10] показано, что индекс кристалличности (ИК) Са растет с возрас- том. Обнаружено, что даже небольшое замещение ионов кальция в поверхностном слое кости ионами меди приводит к резкому возрастанию величины по- верхностной энергии и появлению цитотоксических эффектов. Результаты данных исследований позволя- ют предположить связь между степенью замещения кальция ионами других металлов и скоростью дефор- мации костной ткани [14]. Цель исследования. Изучение с помощью хими- ко-физических методик химического состава костной ткани мыщелков бедренной кости в норме и при де- формирующем артрозе III степени. Материалы и методы. Исследованы 3 интактных бедренных кости (6 проб) и 3 бедренных кости, имеющих внешние признаки деформирующего артроза (6 проб). Мацерация интактных и измененных костей проводилась в одинаковых условиях. Возраст женщин, которым принадлежали кости, также был примерно одинаковым - 65-70 лет. Исследование ГА проводи- лось на установках для РФА, элементный анализ - на атомно-абсорбционном спектрометре «ИМГА-915 МД» на базе химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и института элементорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук. Для приготовления костного гомогенизата в центре медиального и латерального мыщелков бедренной кости на площади 1 см² выпиливали па- раллелепипед с фиксированными размерами ребер. Из его поверхностного и глубокого слоев путем пере- тирания в ониксовой ступке готовился порошок кост- ной ткани. Поверхностный слой представлял собой замыкательную пластинку компактного вещества, а глубокий - слой губчатого вещества, расположенный на глубине 3-5 мм под замыкательной пластинкой. Из каждого слоя получалось по 0,5 см² порошка костной ткани. Полученный костный гомогенизат анализировали в виде сухих порошкообразных проб. Состав различных спилов сравнивали между собой, с контрольными значениями ГА и других соединений. Анализ костной ткани проводили способом рентгенофазовой порош- ковой дифракции на дифрактометре «Huber (CuK²)» сканированием с шагом 0,03² в 2²-диапазоне 6-110² с использованием геометрии Брегга-Брентано. Со- отношение концентраций ГА, а также примесей в компактной и губчатой костных тканях изучали путем сравнения полученных дифракционных пиков с кон- трольными параметрами из кристаллохимической базы данных ICDB посредством программы WinXPow. Выбирали наилучшее соотношение пик/фон в данном рабочем режиме. Качественные и количественные данные рентгено- фазового анализа подтверждали и дополняли с помо- щью элементного анализа и атомно-абсорбционной спектроскопии. Для исследования элементного со- става образцов определяли процентное содержание основных органических элементов (С, H, N) и около 50 гетероэлементов (Ca, Fe, Sr, Ba и др.). Результаты и их обсуждение. В образцах интакт- ной костной ткани, взятой с поверхности (h=0,2 см) обоих мыщелков, присутствуют как органическая, так и неорганическая компоненты. Неорганическая часть содержит в основном ГА и карбонат кальция. ГА пред- ставлен фазами смешанного переменного состава с частичным замещением Ca9-хMex(PO4)6(OH)2. Степень замещения составляет x=0,1-2%, где замещающими химическими элементами были Me - металлы (Fe, Mg, Zn, Sr). Полученные нами данные согласуются с данными других исследователей, наблюдавших заме- щение двухвалентного катиона кальция трехвалетными катионами в структуре ГА [1, 13]. Также в латеральном 178 2 (62) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования мыщелке был обнаружен кристаллический оксалат кальция, что говорит о его насыщенности безазоти- стыми органическими компонентами. Вследствие близких величин значения ионных радиусов Ca и Me, а также наличия сходных сингоний и близких параметров элементарных ячеек у гидрофосфатов этих металлов данное замещение представляется возможным. В изученных образцах костной ткани от поверх- ности в глубину мыщелка количество органической и аморфных фаз нарастает, а концентрация Ca падает. Основным гликопротеином костной ткани является хондроитин-сульфат, состоящий из остатка глюку- роновой кислоты и сульфатированный в положение 4 или 6 N-ацетилглюкозамин. Кроме него, в костной ткани были обнаружены другие гликозаминоглика- ны: гиалуроновая кислота, состоящая из остатков уроновой кислоты и глюкозамина, а также кератан- сульфат, состоящий из остатков глюкозы и 6-сульфо- N-ацетилглюкозамина. Данные классы соединений входят в состав высокомолекулярных кластеров, био- химическая функция которых изучена недостаточно. D.A. Cardoso at al. [7] показали их участие в процессах минерализации, а также повышение концентрации с возрастом. Согласно данным атомно-абсорбционной спек- троскопии, массовые доли углерода и азота возрас- тают незначительно, в то время как массовая доля водорода остается практически неизменной. Это косвенно свидетельствует о возрастании в образцах количества белковой составляющей. Содержание различных химических элементов для нормальной ткани латерального и медиального мыщелков одного костного образца отличается. Это может быть вызвано разной степенью нагрузки на сами мыщелки в про- цессе жизнедеятельности организма, обусловленной несимметричностью и различной формой их сустав- ных поверхностей. Данные качественного и количе- ственного анализов органической и неорганической фаз, полученные методом атомно-абсорбционной спектроскопии, приведены в таблице 1 и полностью согласуются с результатами РФА. В поверхностном слое интактной костной ткани латерального мыщел- ка массовые доли кальция и фосфора находятся в пределах нормы (2, 15). Установлено, что в поверхностном слое латерально- го мыщелка значительно повышено содержание двух- и трехвалентных катионов железа (в три раза), марганца (в два раза), а в медиальном мыщелке - марганца (в два раза), серы (в 1,2 раза), калия (в 1,2 раза), цинка (на четверть) и меди (в 2,3 раза). Это свидетельствует о замещении ионов кальция в структуре ГА вышеука- занными катионами и, как следствие, об изменениях механопрочностных свойств костной ткани. Однозначно идентифицировать весь фазовый состав представляется затруднительным. В поверх- ностном слое медиального мыщелка бедренной кости отмечается некоторое снижение массовых долей кальция и фосфора, а костный индекс находится в пределах нормы (2,1 у. е.). В глубоком слое заметно увеличивается доля орга- нической компоненты. Массовая доля углерода и азо- та в этом слое больше на 0,3 и 0,2% соответственно. Изменение степени кристалличности костной ткани на различной глубине согласуется с S.V. Dorozhkin at al. [9], определявших кальцификацию костей в ком- пактном и губчатом слоях с помощью ИК. Степень минерализации костной ткани влияет на прочностно- механические свойства, что в свою очередь позволяет судить о степени деградации и возможности к вос- становлению данного участка костной ткани. Концентрация гетероэлементов в поверхностном слое костной ткани латерального и медиального мыщелков бедренной кости в норме Таблица 1 Элемент ЛМБ ММБ Ca, м. д. 20±0,5 19,4±0,5* P, м. д. 9,3±0,2 9,2±0,2* Na, м. д. 0,7±0,2 0,6±0,2* Fe, м. д. 0,16±0,004 0,68±0,2* Mg, м. д. 0,21±0,005 0,199±0,005 S, м. д. 0,141±0,004 0,174±0,004 Zn, м. д. 0,034±0,001 0,043±0,001 K, м. д. 0,048±0,001 0,06±0,002 C, % 18,5±0,1 17,3±0,1* H, % 3,15±0,03 3,2±0,03* N, % 4,8±0,1 5,2±0,1* Sr, м. д. 121±6 120±6* Al, м. д. 45±2 46±2* Mn, м. д. 9±0,5 24±1* Cu, м. д. 9±0,5 28±1* Ba, м. д. 15±0,8 16±0,8* Примечание: ЛМБ - латеральный мыщелок бедра; ММБ - медиальный мыщелок бедра; м. д. - массовая доля; * - p<0,05. ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (62) - 2018 179 Экспериментальные исследования В глубоком слое медиального мыщелка бедренной кости массовые доли углерода, азота и водорода увеличиваются на 0,2; 0,3 и 0,6% соответственно, что свидетельствует об общем увеличении доли ор- ганического матрикса и качественно подтверждается увеличением фона в начальном диапазоне углов на дифрактограммах. В медиальном мыщелке, по сравнению с латераль- ным мыщелком, органическая компонента выражена менее явно, но изменяется качественный состав, что согласуется с данными атомно-абсорбиционной спектроскопии и результатами РФА. Разница в массовых долях углерода и азота в глу- боком слое латерального и медиального мыщелков составляет - 0,7 и + 0,7 массовых процентов соответ- ственно, в то время как разница в массовых процентах по водороду составляет лишь + 0,2. Это свидетель- ствует о большем количестве гликозамингликановой и коллагеновой составляющих в медиальном мыщелке. При деформирующем артрозе в двух наблюде- ниях в губчатом веществе медиального мыщелка (h=0,5 см) была обнаружена костная киста размером 1×0,7 см. Элементный состав органической части кисты показал, что массовая доля углерода по срав- нению с интактными поверхностями медиального и латерального мыщелков в 3,5 раза выше, водо- рода - более чем в два раза. Массовая доля азота содержимого кисты по сравнению с костной тканью в губчатом веществе меньше в семь с половиной раз. Эти данные говорят о небелковом составе со- держимого кисты. Исследование фазового состава кисты позволило выявить наличие стеаратов, пальмитатов, бензоатов, уратов, капратов и цитратов натрия. Эти углеводные компоненты входят в состав гликозаминогликанов костной ткани. Неорганическая кристаллическая составляющая по результатам РФА в кисте не за- фиксирована. Исследование патологически измененных об- разцов костной ткани при деформирующем артрозе III степени выявило наличие повышенного уровня фона рентгеноаморфной компоненты в начальном угле рентгенограммы. Сравнение дифрактограмм порошка костной ткани в области остеофита с по- рошком нормальной костной ткани свидетельствует о снижении степени кристалличности гидроксиапатита в патологически изменённой кости. В данном случае включение примесных фаз и степень замещения Ca ионами других металлов, возможно, являются при- чинами повышенной твёрдости костной ткани [8]. Установлено, что поражение мыщелков бедренной кости при деформирующем артрозе развивается от поверхности к глубинным слоям. Это отчетливо вид- но при сравнении дифрактограмм горизонтальных срезов. Состав самых глубоких слоев губчатого вещества мыщелков бедренной кости при деформирующем артрозе максимально близок к составу интактной кости. При этом в поверхностном слое мыщелков концентрации гетероэлементов изменялись неодно- родно. Количество кальция и фосфора выросло на 20%, при этом костный индекс остался прежним (2,11 у. е.), содержание железа снизилось на 40%. Концен- трации микроэлементов алюминия и бария выросли почти в полтора раза, в то время как доли марганца и меди уменьшились. Массовые доли углерода и азота снизились на 20%, что свидетельствует о снижении доли белковой компоненты среди органических ве- ществ. Вместе с тем отчетливо определяется прямая зависимость между уровнем нарушения обмена ве- ществ в костной ткани и степенью деформирующего артроза. Выявлено, что в составе ГА из остеофитной пробы в сравнении с нормальным ГА существенно повышено содержание железа, цинка, бария и других элементов. Заключение. Установлено, что поверхностные и глубокие слои мыщелков интактной бедренной кости при деформирующем артрозе III степени отличаются по химическому составу. При этом обнаружены отли- чия в строении и химическом составе костной ткани медиального и латерального мыщелков в норме. Полученные данные и используемые методики могут применяться для качественной оценки состояния костной ткани.

About the authors

E S Ihalainen

I V Gayvoronsky

V V Khominets

A A Semenov

O M Fandeeva

References

Supplementary files