Comparative chemical composition analysis of femoral condyles bone tissue in health and in deforming arthrosis

Abstract


A comparative analysis of the chemical composition of the medial and lateral condyles of the femur in norm and with deforming arthrosis of the third degree is presented. It was found that when the bone tissue of the femur is degraded from the surface, a decrease in crystallinity is observed in depth, quantitative and qualitative changes in the organic bone matrix, in particular, a decrease in the proportion of the protein component, a change in the phase inorganic composition, and an increased degree of substitution of calcium in hydroxyapatite for ions of other metals. And the most dramatic changes are observed in bone tissue located near the pathologically deformed areas. It is shown that the data for normal bone tissue of the lateral and medial condyle of one specimen differ, which can be caused by different degrees of stress on the condyles themselves in the process of vital activity of the organism caused by asymmetry and a different shape of their articular surfaces. With deforming arthrosis in the surface layer of bone tissue, the concentration of calcium and a number of other metals increases, while the proportion of the protein component decreases. It was revealed that in the affected bone replacement of phosphate tetrahedra with carbonate ions occurs, as well as substitution of cations of divalent calcium with ions of other metals such as copper and manganese, and especially ferric cations. This breaks the overall structure of the crystal lattice of hydroxyapatite and affects the biomechanical properties of the surface, in particular, the reduction of trophism and the elasticity of the surface. In osteophyte tests, partial replacement of phosphate groups with carbonate groups occurs. Isomorphic structural substitutions caused by deposition of crystalline impurities lead to a change in the ratio of calcium and phosphorus concentrations. Excessive deposition of calcium salts leads to the formation of osteophytes.

Введение. Костная ткань - одна из важнейших тканей организма, обеспечивающая в его жизне- деятельности различные функции [2]. Нарушения функционирования костной ткани проявляются в виде ряда заболеваний. В основе патогенеза мно- гих из них лежит изменение химического состава костей, а следовательно, и изменение в организме в целом обменных процессов. Естественно, что количественные изменения химического состава костной ткани отражаются на физических свойствах кости. Основными химическими компонентами костной ткани являются гидроксиапатит, другие минеральные вещества и органический матрикс. Исследование градиента концентрации гидрокси- апатита и минеральных включений в ячеистой струк- туре кости позволит показать наличие качественных и количественных изменений в неорганическом компоненте трубчатых костей и установить их взаи- мосвязь с имеющимися в них морфологическими преобразованиями [4]. Состав костных тканей человека изучают с помо- щью физико-химических методик, таких как рентге- нофазовый анализ (РФА), рентгенофлюоресцентный анализ, инфракрасная спектрометрия, ядерно-маг- нитный резонанс и т. д. [6, 3]. В настоящее время РФА применяется для исследования костных объектов в палеонтологии и археологии, а также для определения биосовместимости различных имплантов с костью в травматологии и ортопедии [12]. Результаты научных исследований с успехом при- меняются в передовых медицинских исследованиях, например в ортопедии и стоматологии. Изучение дифракционных спектров костей позволяет получить новую и крайне важную информацию о соотношении кальция и фосфора в организме, а также об изме- нениях костного индекса кости с течением жизни организма. Данная информация очень важна в биоме- дицинской инженерии, так как покровные материалы имплантов сильно влияют на межповерхностные вза- имодействия в биологических системах, в частности при имплантации в костную или зубную ткани. Основным минеральным компонентом костной ткани является гидроксиапатит (ГА). Функциональные свойства ГА сильно зависят от его структуры, сте- реометрического соотношения кальция и фосфора, степени кристалличности, а также размеров кри- ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (62) - 2018 177 Экспериментальные исследования сталлических фаз на поверхности и в объёме кости. В настоящее время растет интерес к использованию биоматериалов на основе ГА для восстановления по- вреждённых костей и скелетных дефектов. Проводит- ся ряд исследований, направленных на определение биосовместимости имплантов, имеющих поверхност- ное напыление металлов, с костью [11]. Данные о морфологии костной ткани могут быть получены с помощью различных микроскопических методик. Н.В. Старостенко и др. [5] указывают на то, что кости содержат внутренний трабекулярный слой с 50-90%-ной пористостью, в то время как наружный слой имеет пористость порядка 5-12%. Эти слои сильно отличаются по размеру пор, общей пористости, механическим свойствам и поверхност- ному окружению. Известно, что ГА образует гексогональную кри- сталлическую решётку с пространственной груп- пой P63/M и состоит из 44 атомов в элементарной ячейке [4]. Элементарная ячейка содержит два раз- личных кристаллографических типа ионов кальция, расположенных в цепочку вдоль грани элементар- ной ячейки и вдоль винтовой оси. Столбчатый каль- ций образует параллель с c-осью и располагается приблизительно на середине высоты между двумя ионами кислорода. Кальций, распложенный по винтовой оси, связывает расположенные в центре OH-группы и образует равносторонний треугольник. Данные треугольники ориентированы вдоль оси с в ab плоскости. Размер пластинок ГА составляет око- ло 50 нм в длину, 25 нм в ширину и 3 нм в толщину. В качестве нормального показателя кальцификации кости используют термин «костный индекс» (КИ), в норме имеющий значения 1,8-2,2 у. е. В то же время возможно другое представление степени кристал- личности, такое как соотношение количества атомов кальция к количеству атомов фосфора (10:6). Меди- цинские исследования все чаще сфокусированы на понимании влияния структуры ГА на биохимические свойства поверхности новых медицинских компо- зитных материалов. В исследовании H. Jenssen at al. [10] показано, что индекс кристалличности (ИК) Са растет с возрас- том. Обнаружено, что даже небольшое замещение ионов кальция в поверхностном слое кости ионами меди приводит к резкому возрастанию величины по- верхностной энергии и появлению цитотоксических эффектов. Результаты данных исследований позволя- ют предположить связь между степенью замещения кальция ионами других металлов и скоростью дефор- мации костной ткани [14]. Цель исследования. Изучение с помощью хими- ко-физических методик химического состава костной ткани мыщелков бедренной кости в норме и при де- формирующем артрозе III степени. Материалы и методы. Исследованы 3 интактных бедренных кости (6 проб) и 3 бедренных кости, имеющих внешние признаки деформирующего артроза (6 проб). Мацерация интактных и измененных костей проводилась в одинаковых условиях. Возраст женщин, которым принадлежали кости, также был примерно одинаковым - 65-70 лет. Исследование ГА проводи- лось на установках для РФА, элементный анализ - на атомно-абсорбционном спектрометре «ИМГА-915 МД» на базе химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и института элементорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук. Для приготовления костного гомогенизата в центре медиального и латерального мыщелков бедренной кости на площади 1 см² выпиливали па- раллелепипед с фиксированными размерами ребер. Из его поверхностного и глубокого слоев путем пере- тирания в ониксовой ступке готовился порошок кост- ной ткани. Поверхностный слой представлял собой замыкательную пластинку компактного вещества, а глубокий - слой губчатого вещества, расположенный на глубине 3-5 мм под замыкательной пластинкой. Из каждого слоя получалось по 0,5 см² порошка костной ткани. Полученный костный гомогенизат анализировали в виде сухих порошкообразных проб. Состав различных спилов сравнивали между собой, с контрольными значениями ГА и других соединений. Анализ костной ткани проводили способом рентгенофазовой порош- ковой дифракции на дифрактометре «Huber (CuK²)» сканированием с шагом 0,03² в 2²-диапазоне 6-110² с использованием геометрии Брегга-Брентано. Со- отношение концентраций ГА, а также примесей в компактной и губчатой костных тканях изучали путем сравнения полученных дифракционных пиков с кон- трольными параметрами из кристаллохимической базы данных ICDB посредством программы WinXPow. Выбирали наилучшее соотношение пик/фон в данном рабочем режиме. Качественные и количественные данные рентгено- фазового анализа подтверждали и дополняли с помо- щью элементного анализа и атомно-абсорбционной спектроскопии. Для исследования элементного со- става образцов определяли процентное содержание основных органических элементов (С, H, N) и около 50 гетероэлементов (Ca, Fe, Sr, Ba и др.). Результаты и их обсуждение. В образцах интакт- ной костной ткани, взятой с поверхности (h=0,2 см) обоих мыщелков, присутствуют как органическая, так и неорганическая компоненты. Неорганическая часть содержит в основном ГА и карбонат кальция. ГА пред- ставлен фазами смешанного переменного состава с частичным замещением Ca9-хMex(PO4)6(OH)2. Степень замещения составляет x=0,1-2%, где замещающими химическими элементами были Me - металлы (Fe, Mg, Zn, Sr). Полученные нами данные согласуются с данными других исследователей, наблюдавших заме- щение двухвалентного катиона кальция трехвалетными катионами в структуре ГА [1, 13]. Также в латеральном 178 2 (62) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования мыщелке был обнаружен кристаллический оксалат кальция, что говорит о его насыщенности безазоти- стыми органическими компонентами. Вследствие близких величин значения ионных радиусов Ca и Me, а также наличия сходных сингоний и близких параметров элементарных ячеек у гидрофосфатов этих металлов данное замещение представляется возможным. В изученных образцах костной ткани от поверх- ности в глубину мыщелка количество органической и аморфных фаз нарастает, а концентрация Ca падает. Основным гликопротеином костной ткани является хондроитин-сульфат, состоящий из остатка глюку- роновой кислоты и сульфатированный в положение 4 или 6 N-ацетилглюкозамин. Кроме него, в костной ткани были обнаружены другие гликозаминоглика- ны: гиалуроновая кислота, состоящая из остатков уроновой кислоты и глюкозамина, а также кератан- сульфат, состоящий из остатков глюкозы и 6-сульфо- N-ацетилглюкозамина. Данные классы соединений входят в состав высокомолекулярных кластеров, био- химическая функция которых изучена недостаточно. D.A. Cardoso at al. [7] показали их участие в процессах минерализации, а также повышение концентрации с возрастом. Согласно данным атомно-абсорбционной спек- троскопии, массовые доли углерода и азота возрас- тают незначительно, в то время как массовая доля водорода остается практически неизменной. Это косвенно свидетельствует о возрастании в образцах количества белковой составляющей. Содержание различных химических элементов для нормальной ткани латерального и медиального мыщелков одного костного образца отличается. Это может быть вызвано разной степенью нагрузки на сами мыщелки в про- цессе жизнедеятельности организма, обусловленной несимметричностью и различной формой их сустав- ных поверхностей. Данные качественного и количе- ственного анализов органической и неорганической фаз, полученные методом атомно-абсорбционной спектроскопии, приведены в таблице 1 и полностью согласуются с результатами РФА. В поверхностном слое интактной костной ткани латерального мыщел- ка массовые доли кальция и фосфора находятся в пределах нормы (2, 15). Установлено, что в поверхностном слое латерально- го мыщелка значительно повышено содержание двух- и трехвалентных катионов железа (в три раза), марганца (в два раза), а в медиальном мыщелке - марганца (в два раза), серы (в 1,2 раза), калия (в 1,2 раза), цинка (на четверть) и меди (в 2,3 раза). Это свидетельствует о замещении ионов кальция в структуре ГА вышеука- занными катионами и, как следствие, об изменениях механопрочностных свойств костной ткани. Однозначно идентифицировать весь фазовый состав представляется затруднительным. В поверх- ностном слое медиального мыщелка бедренной кости отмечается некоторое снижение массовых долей кальция и фосфора, а костный индекс находится в пределах нормы (2,1 у. е.). В глубоком слое заметно увеличивается доля орга- нической компоненты. Массовая доля углерода и азо- та в этом слое больше на 0,3 и 0,2% соответственно. Изменение степени кристалличности костной ткани на различной глубине согласуется с S.V. Dorozhkin at al. [9], определявших кальцификацию костей в ком- пактном и губчатом слоях с помощью ИК. Степень минерализации костной ткани влияет на прочностно- механические свойства, что в свою очередь позволяет судить о степени деградации и возможности к вос- становлению данного участка костной ткани. Концентрация гетероэлементов в поверхностном слое костной ткани латерального и медиального мыщелков бедренной кости в норме Таблица 1 Элемент ЛМБ ММБ Ca, м. д. 20±0,5 19,4±0,5* P, м. д. 9,3±0,2 9,2±0,2* Na, м. д. 0,7±0,2 0,6±0,2* Fe, м. д. 0,16±0,004 0,68±0,2* Mg, м. д. 0,21±0,005 0,199±0,005 S, м. д. 0,141±0,004 0,174±0,004 Zn, м. д. 0,034±0,001 0,043±0,001 K, м. д. 0,048±0,001 0,06±0,002 C, % 18,5±0,1 17,3±0,1* H, % 3,15±0,03 3,2±0,03* N, % 4,8±0,1 5,2±0,1* Sr, м. д. 121±6 120±6* Al, м. д. 45±2 46±2* Mn, м. д. 9±0,5 24±1* Cu, м. д. 9±0,5 28±1* Ba, м. д. 15±0,8 16±0,8* Примечание: ЛМБ - латеральный мыщелок бедра; ММБ - медиальный мыщелок бедра; м. д. - массовая доля; * - p<0,05. ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 2 (62) - 2018 179 Экспериментальные исследования В глубоком слое медиального мыщелка бедренной кости массовые доли углерода, азота и водорода увеличиваются на 0,2; 0,3 и 0,6% соответственно, что свидетельствует об общем увеличении доли ор- ганического матрикса и качественно подтверждается увеличением фона в начальном диапазоне углов на дифрактограммах. В медиальном мыщелке, по сравнению с латераль- ным мыщелком, органическая компонента выражена менее явно, но изменяется качественный состав, что согласуется с данными атомно-абсорбиционной спектроскопии и результатами РФА. Разница в массовых долях углерода и азота в глу- боком слое латерального и медиального мыщелков составляет - 0,7 и + 0,7 массовых процентов соответ- ственно, в то время как разница в массовых процентах по водороду составляет лишь + 0,2. Это свидетель- ствует о большем количестве гликозамингликановой и коллагеновой составляющих в медиальном мыщелке. При деформирующем артрозе в двух наблюде- ниях в губчатом веществе медиального мыщелка (h=0,5 см) была обнаружена костная киста размером 1×0,7 см. Элементный состав органической части кисты показал, что массовая доля углерода по срав- нению с интактными поверхностями медиального и латерального мыщелков в 3,5 раза выше, водо- рода - более чем в два раза. Массовая доля азота содержимого кисты по сравнению с костной тканью в губчатом веществе меньше в семь с половиной раз. Эти данные говорят о небелковом составе со- держимого кисты. Исследование фазового состава кисты позволило выявить наличие стеаратов, пальмитатов, бензоатов, уратов, капратов и цитратов натрия. Эти углеводные компоненты входят в состав гликозаминогликанов костной ткани. Неорганическая кристаллическая составляющая по результатам РФА в кисте не за- фиксирована. Исследование патологически измененных об- разцов костной ткани при деформирующем артрозе III степени выявило наличие повышенного уровня фона рентгеноаморфной компоненты в начальном угле рентгенограммы. Сравнение дифрактограмм порошка костной ткани в области остеофита с по- рошком нормальной костной ткани свидетельствует о снижении степени кристалличности гидроксиапатита в патологически изменённой кости. В данном случае включение примесных фаз и степень замещения Ca ионами других металлов, возможно, являются при- чинами повышенной твёрдости костной ткани [8]. Установлено, что поражение мыщелков бедренной кости при деформирующем артрозе развивается от поверхности к глубинным слоям. Это отчетливо вид- но при сравнении дифрактограмм горизонтальных срезов. Состав самых глубоких слоев губчатого вещества мыщелков бедренной кости при деформирующем артрозе максимально близок к составу интактной кости. При этом в поверхностном слое мыщелков концентрации гетероэлементов изменялись неодно- родно. Количество кальция и фосфора выросло на 20%, при этом костный индекс остался прежним (2,11 у. е.), содержание железа снизилось на 40%. Концен- трации микроэлементов алюминия и бария выросли почти в полтора раза, в то время как доли марганца и меди уменьшились. Массовые доли углерода и азота снизились на 20%, что свидетельствует о снижении доли белковой компоненты среди органических ве- ществ. Вместе с тем отчетливо определяется прямая зависимость между уровнем нарушения обмена ве- ществ в костной ткани и степенью деформирующего артроза. Выявлено, что в составе ГА из остеофитной пробы в сравнении с нормальным ГА существенно повышено содержание железа, цинка, бария и других элементов. Заключение. Установлено, что поверхностные и глубокие слои мыщелков интактной бедренной кости при деформирующем артрозе III степени отличаются по химическому составу. При этом обнаружены отли- чия в строении и химическом составе костной ткани медиального и латерального мыщелков в норме. Полученные данные и используемые методики могут применяться для качественной оценки состояния костной ткани.

E S Ihalainen

I V Gayvoronsky

V V Khominets

A A Semenov

O M Fandeeva

  1. Брик, А.Б. Биоминералогические подходы к изучению изо- морфных замещений и мест локализации примесей в наноразмерных подсистемах эмали и дентина зубов / А.Б. Брик [и др.] // Минералогич. журн. - 2008. - Т. 30. - С. 13-25.
  2. Гайворонский, И.В. Вариантная анатомия и морфометриче- ская характеристика мыщелков большеберцовой кости взрослого человека / И.В. Гайворонский [и др.] // Морфолог. науки и клин. мед. - СПб., 2015. - С. 44-47.
  3. Лемешева, С.А. Состав и структура костных тканей человека как отражение процессов патогенной минерализации при коксартрозе / С.А. Лемешева [и др.] // Вестн. Ом. ун-та. - 2010. - № 2. - С. 106-112.
  4. Накоскин, А.Н. Изменения биохимического состава бедренной кости у людей разного возраста / А.Н. Накоскин [и др.] // Проблемы старения и долголетия. - 2008. - Т. 17. - С. 21-26.
  5. Старостенко, Н.В. Замещение кальция и фосфора на пра- зеодим и кремний в структуре гидроксиапатита / Н.В. Старостенко [и др.] // Журн. неорган. химии. - 2012. - Т. 57. - С. 1274-1277.
  6. Chappard, С. Analysis of hydroxyapatite crystallites in subchondral bone by Fourier transform infrared spectroscopy and powder neutron diffraction methods / C. Chappard [at al.] // Comptes Rendus Chimie. - 2015. - Vol. 19. - P. 1625-1630.
  7. Cardoso, D.A. Synthesis and application of nanostructured calcium phosphate ceramics for bone regeneration / D.A. Cardoso [at al.] // J. Biomed. Mater. Res. Part B. - 2012. - P. 2316-2326.
  8. Chandramohan, D. Contribution of Biomaterials to Orthopaedics as Bone Implants - A Review / D. Chandramohan [at al.] // International Journal of Materials Science. - 2010. - Vol. 5. - P. 399-409.
  9. Dorozhkin, S.V. Biological and Medical Significance of Calcium Phosphates / S.V. Dorozhkin [at al.] // Angew. Chem. Int. Ed. - 2002. - Vol. 41. - P. 3130-3146.
  10. Jenssen, H. Antimicrobial peptides on calcium phosphate-coated titanium for the prevention of implant-associated infections / H. Jenssen [at al.] // Biomaterials. - 2010. - Vol. 31. - P. 9519-9526. 180 2 (62) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования
  11. Kay, M.I. Crystal structure of hydroxyapatite / M.I. Kay [at al.] // Nature. - 1964. - Vol. 204. - P. 1050-1052.
  12. Nacarino-Meneses, С. Multidisciplinary characterization of the long-bone cortex growth patterns through sheep’s ontogeny / C. Nacarino-Meneses [at al.] // Journal of Structural Biology. - 2015. - Vol. 191. - P. 1-9.
  13. Rao, D.V. Synchrotron-based XRD from rat bone of different age groups / D.V. Rao [at al.] // Materials Science and Engineering C. - 2017. - № 74. - P. 207-218.
  14. Schaffler, M.B. Age-related changes in physicochemical properties of mineral crystals are related to impaired mechanical function of cortical bone / M.B. Schaffler [at al.] // Bone. - 2004. - Vol. 34. - P. 443-453.

Views

Abstract - 3

PDF (Russian) - 56

Cited-By



Copyright (c) 2018 Ihalainen E.S., Gayvoronsky I.V., Khominets V.V., Semenov A.A., Fandeeva O.M.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies