Experimental evaluation of the effectiveness of local treatment of skin burns with сarbopol easier to disperse 2020 hydrogel with human leukemia differentiation factor-6 peptide

Full Text

Введение. По данным Росстата, в 2017 г. в Российской Федерации зарегистрировано 278,2 ты- сяч пациентов с диагнозом термический и химический ожог, при этом среди них 68,7 тысяч - дети [9]. Ожоги являются одной из основных причин инвалидности взрослого и детского населения развитых стран. Экономические затраты на лечение таких пострадав- ших представляют значительную проблему. Сводные данные свидетельствуют о снижении частоты тер- мических и химических поражений среди населения России за последнее десятилетие, однако проблема лечения таких пострадавших остается актуальной и дискутабельной [10]. Современная тактика лечения ожоговых пораже- ний является мультидисциплинарой и проводится с учетом особенностей патогенеза ожоговой болезни и её осложнений [3]. Благодаря прогрессу медицин- ской науки внедрены патогенетически обоснованные методики антибактериальной терапии, иммунокор- рекции и местного лечения ран [2]. Перспективным представляется разработка новых методик лечения поверхностных и глубоких ожоговых поражений биотехнологическими, в том числе клеточными про- дуктами, биополимерными раневыми покрытиями с живыми клетками - скаффолдами [1, 5]. Один из перспективных путей повышения эффек- тивности лечения ожоговых поражений предусма- тривает использование ростовых стимуляторов и факторов регенерации, в частности эпидермального, фибробластического, тромбоцитарных факторов ро- 148 3 (63) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования ста: собственно тромбоцитарный фактор роста A+B, инсулиноподобные факторы роста I, II. Среди них привлекает внимание пептид человеческий лейкозный фактор дифференцировки (ЧЛФД), выделенный из культуральной среды клеток человеческого промие- лоцитарного лейкоза HL-60 в 1994 г. Установлено, что субстанция ЧЛФД вызывает дифференцировку клеток по гранулоцитарному пути [6]. В структуре обнаружен шестичленный фрагмент ЧЛФД-6, который обеспечивает способность полноразмерного факто- ра индуцировать дифференцировку и ингибировать пролиферацию клеток, в том числе HL-60 [10]. Кроме этого, пептид обладает способностью взаимодей- ствовать с липидами клеточных мембран, что сказы- вается на активности цитокинов, задействованных в пролиферации и дифференцировке клеток [6]. Е.Д. Даниленко и др. [4] показали, что ЧЛФД-6 усиливает окислительно-восстановительные процессы в клетках и повышает метаболическую активность макрофагов. В сыворотке крови определяются ЧЛФД-6 и антитела к этому пептиду, что позволяет предположить о гумо- ральной регуляции его синтеза. Так как пептид ЧЛФД- 6 не имеет специфических рецепторов на клеточной мембране, то его воздействие может распространять- ся на различные популяции клеток организма [10]. Основой для создания перспективных раноза- живляющих средств и рецептур на основе пептида ЧЛФД-6 может послужить гидрогель редкосшитых акриловых полимеров (карбополов), в частности легкодиспергируемый карбопол 2020. На их основе образуются стабильные гидрогели, они термически и химически устойчивы. Получены экспериментальные данные об эффективности применения гидрогелей для лечения обширных ран и ожогов [7]. Цель исследования. Оценить эффективность и влияние белка ЧЛФД-6 в гидрогеле легкодиспергиру- емого карбопола 2020 на репаративную регенерацию при ожогах кожи. Материалы и методы. В эксперименте уча- ствовало 48 самцов крыс линии Wistar-Kyoto массой 230-250 г. Все манипуляции выполнялись под общим ингаляционным наркозом в асептических условиях. Ожог воспроизводили по собственной оригинальной методике (рационализаторское предложение Во- енно-медицинской академии имени С.М. Кирова № 14287/1 от 19.01.2016). После подготовки операци- онного поля животное фиксировали к лабораторному столу. Площадь ожога составляла 16 см2 (около 10% от площади тела). На депилированную кожу спины животного помещали датчик электротермопары муль- тиметра «Electroline» (Китай), которым определяли температуру кожи и металлической нагревательной пластины. Время экспозиции - 10 с при температуре на поверхности кожи 95-97оС. Для возможности нанесения на раневую поверх- ность пептид ЧЛФД-6 в различных разведениях был растворен в гидрогеле редкосшитых акриловых полимеров, который представляет собой электрофизически обработанную частично модулированным сигналом электрического поля воду (99,55%) и поли- мер 0,45% акриловой кислоты легкодиспергируемого карбопола (рис. 1). Всем животным спустя 60 мин после ожога выпол- нялась некрэктомия до собственной фасции, края раны фиксировались к подлежащим тканям узловыми шва- ми. Гидрогель, содержащий пептид ЧЛФД-6, ежеднев- но наносили на поверхность раны в течение 7 суток. Животные были разделены на 6 групп - по 8 живот- ных в каждой с учетом концентрации пептида ЧЛФД-6 в геле. В 1-й группе концентрация пептида составила 0,01%, во 2-й группе - 0,001%, в 3-й группе - 0,0001%, в 4-й группе - 0,00001%, в 5-й группе гидрогель на- носился без пептида ЧЛФД-6, в 6-й группе выполня- лась только ранняя хирургическая некрэктомия без последующего лечения. Оценку эффективности лечения выполняли еже- дневно, осуществляли осмотр ран, отмечали характер отделяемого, а также оценку осложнений и летальные исходы. Планиметрически по методике Л.Н. Поповой [12] определяли площадь ожога и вычисляли индекс заживления по следующей формуле: Индекс заживления = , где S - площадь ожога при предыдущем измерении, мм2; Sn - площадь ожога при данном измерении, мм2, Т - интервал между измерениями, сут. Отбор биоптатов для гистологического исследо- вания осуществляли на 14-е и 28-е сутки, их фикси- ровали в 10% растворе формалина с последующей проводкой через спирты восходящей концентрации (30-96%) и заливкой в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, ис- следовали методами световой микроскопии. В ходе исследований соблюдались положения «Ру- ководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [12]. Полученные данные обрабатывались методами вариационной статистики. Критерием достоверности считали величину p<0,05 при сравнении с группой кон- троля, в которой применялся гидрогель без пептида ЧЛФД-6, и величину p<0,2 при сравнении с группой контроля, в которой выполнялась некрэктомия без дополнительного лечения. Результаты и их обсуждение. Установлено, что выполнение ранней хирургической некрэктомии в зоне глубокого ожога кожи с последующим нанесе- нием гидрогеля с пептидом ЧЛФД-6 сопровождалось достоверным сокращением площади раны, при этом величина показателей определялась концентрацией пептида в гидрогеле. В частности, на 28-е сутки при концентрации пептида 0,01% площадь раны умень- шилась на 94,32% (до 0,91 см2), при концентрации 0,001% - на 74,44% (до 4,09 см2), при концентрации 0,0001% - на 91,32% (до 1,39 см2), при концентрации 0,00001% - на 94,38% (до 0,90 см2); в группе, в кото- ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 3 (63) - 2018 149 Экспериментальные исследования рой наносился гидрогель без ЧЛФД-6, - на 93,04% (до 1,13 см2); в группе, в которой выполнялась только некрэктомия, - на 90,38% (до 1,54 см2), таблица 1. Частота нагноения ран в анализируемых группах составила: 1 животное в 1-й группе, 2 животных в 3-й и 5-й группах, 3 животных во 2-й группе, 5 животных в 6-й группе, в 4-й группе нагноения ран не наблюда- лось (рис. 2). При гистологическом исследовании биоптатов ран установлено, что на 14-е сутки морфологическая картина в зоне ожога имела ряд особенностей с учё- том выбора способа лечения. Послеоперационная рана в различных группах животных была различной площади, покрыта массами фибрина, густо инфиль- трированного нейтрофильными лейкоцитами (рис. 3). Дно раневого дефекта представлено грануля- ционной тканью, распространяющейся вплоть до мышечной фасции. Макрофаги и нейтрофилы рас- полагаются диффузно, наиболее густо инфильтри- рованы поверхностные слои. В прилежащих к фасции отделах отмечаются небольшие очаги инфильтрации лимфоцитами. В 4-й группе смешаноклеточная ин- фильтрация незначительно распространялась на окружающие ткани, в то время как в 1-й, 2-й и 3-й группах констатированы достаточно крупные очаги субэпидермальной лейкоцитарной инфильтрации. В 5-й группе нейтрофильные лейкоциты располагаются не только в дерме, но и в самом эпидермисе, форми- руя немногочисленные микроабсцессы. Кроме того, в грануляционной ткани определяются многочисленные пролиферирующие полнокровные сосуды капилляр- ного типа. Количество микрососудов в грануляцион- ной ткани в группах существенно различалось (рис. 4). На 28-е сутки дно дефекта было представлено грубоволокнистой соединительной тканью с большим количеством крупных фибробластов (рис. 5). В соединительной ткани сохраняется очаговая инфильтрация лимфоцитами и макрофагами: в 1-й и 4-й группах с незначительным числом нейтрофиль- ных лейкоцитов, в то время как в 2-й и 3-й группах их количество было умеренное. В 5-й группе число нейтрофильных лейкоцитов также умеренное, но в ряде наблюдений выявлены мелкие внутридермаль- ные абсцессы, лимфогистиоцитарная инфильтрация более выражена, очаги несколько крупнее, сливаются друг с другом. Кроме того, в 5-й группе лейкоцитар- ные инфильтраты распространяются на эпидермис по краям дефекта. Сосуды соединительной ткани представлены капиллярами и мелкими венулами. Эндотелиоциты этих сосудов крупные, пролифериру- ющие, с округлыми гиперхромными ядрами и скудной эозинофильной цитоплазмой. В этот же срок в биоптатах, отобранных у живот- ных 6-й группы, перенесших раннюю хирургическую некрэктомию без местного лечения, в отличие от других групп, на дне дефекта располагался слой гра- нуляционной ткани с крупноочаговой инфильтрацией преимущественно нейтрофильными лейкоцитами (рис. 6). Очаги локализовались непосредственно под фибринозным экссудатом, на поверхности дефекта. В отдельных участках отмечается формирование гру- боволокнистой соединительной ткани с многочислен- ными, достаточно крупными фибробластами. Сосуды в ткани на дне дефекта полнокровные, представлены множественными капиллярами и немногочисленными мелкими венулами с пролиферирующим эндотелием. Эпидермис по краям дефекта с выраженным аканто- зом, гиперкератозом и мелкоочаговой лейкоцитарной инфильтрацией. Заключение. Применение гидрогеля, содержа- щего пептид ЧЛФД-6, может являться перспективной методикой оптимизации течения процессов репара- тивной регенерации при ожогах кожи. На фоне его применения в различных концентрациях к 28-м суткам площадь ран сокращается на 94,38%, а частота раз- вития гнойных осложнений раневого процесса при этом снижается на 62,5%. Наилучшие результаты отмечаются при местном использовании гидрогеля с минимальным содер- жанием пептида ЧЛФД-6, разведенного 0,00001%. В данном случае у крыс площадь раневой поверх- ности на 28-е сутки сократилась с 16 см2 до 0,90 см2 (т. е. на 94,38%), при этом гнойных осложнений не отмечено. При местном применении гидрогеля с 0,01% концентрацией пептида ЧЛФД-6 наблюдалась схожая динамика уменьшения площади ран, одна- ко частота гнойных осложнений оказалась выше (12,5%) и отмечен один летальный исход. В группе, в которой наносился гидрогель без пептида ЧЛФД-6, Таблица 1 Результаты планиметрической оценки эффективности ранозаживляющих средств Группа Площадь раны в сроки (сутки), см2 Группа 7 14 21 28 1-я 8,78±1,34*, ** 3,78±1,49*, ** 1,80±0,82*, ** 0,91±1,02 *, ** 2-я 12,20±1,32*, ** 10,29±1,46*, ** 7,88±0,83*, ** 4,09±1,02*, ** 3-я 11,08±1,30*, ** 9,13±1,46*, ** 2,93±0,83*, ** 1,39±1,03 *, ** 4-я 11,68±1,31*, ** 6,24±1,47*, ** 0,94±0,81*, ** 0,90±1,00*, ** 5-я 9,02±1,31 4,63±1,47 1,42±0,84 1,13±1,01 6-я 12,68±1,79 8,49±2,45 3,00±0,14 1,54±0,18 Примечание: * - различия по сравнению с гидрогелем без ЧЛФД-6, p<0,05; ** - по сравнению с группой, в которой выполнялась ранняя хирургическая некрэктомия, p<0,2. 150 3 (63) - 2018 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования Рис. 1. Структура гидрогеля легкодиспергируемого карбопола 2020. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. ×1000 Рис. 2. Частота развития гнойного воспаления в ранах, с учетом способа лечения Рис. 3. Массивная инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами грануляционной ткани, фибрин на ее поверхности, 1-я группа, 14-е сутки. Окраска гематоксилин-эозином, ув. ×50 Рис. 4. Среднее число микрососудов в грануляционной ткани Рис. 5. Грубоволокнистая соединительная ткань с очаговой инфильтрацией лимфоцитами и макрофагами, 4-я группа, 28-е сутки. Окраска гематоксилином-эозином, ув. ×100 Рис. 6. Грануляционная ткань на дне дефекта, 6-я группа, 28-е сутки. Окраска гематоксилин-эозином, ув. ×150 площадь раневого дефекта на 28-е сутки наблюде- ния оказалась больше на 25,56% (1,13 см2), чем в группе с содержанием пептида ЧЛФД-6, равным 0,00001%, а частота гнойных осложнений составила 25%. В группе, в которой выполнялась только ранняя хирургическая некрэктомия, на 28-е сутки площадь раны оказалась больше на 71,11% (1,54 см2) по срав- нению с группой, где содержание пептида ЧЛФД-6 равнялось 0,00001%, а частота гнойных осложнений составила 62,5%. Отсутствие гнойных осложнений в группе с минимальным содержанием пептида можно связать с комбинированным действием ги- дрогеля карбопола как детерминанты заживления ран во влажной среде и оптимальной концентрацией пептида ЧЛФД-6, что обеспечивает его противовос- палительное действие.

About the authors

E V Zinoviev

V N Tsygan

I V Artsimovich

Email: ilyaartsimovich@gmail.com

M S Asadulayev

M B Paneyakh

V V Zubov

S A Lukyanov

D V Kostyakov

A A Zhilin

I M Lopatin

A A Umanskaya

K F Osmanov

S N Kravtsov

A V Apchel

Yu A Zolotarev

A K Dadayan

K A Dadayan

References

Supplementary files