Отправить статью по E-mail Противолучевая активность препаратов, содержащих дисульфиды глутатиона
- Авторы: Антушевич А.Е.1, Гребенюк А.Н.2, Климов А.Г.3, Ярцева А.А.3, Антонов В.Г.1, Болехан А.В.1, Богданова Е.Г.1
-
Учреждения:
- Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
- Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
- Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
- Выпуск: Том 21, № 1 (2019)
- Страницы: 127-130
- Раздел: Экспериментальные исследования
- Статья получена: 06.06.2019
- Статья опубликована: 15.12.2019
- URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/13051
- DOI: https://doi.org/10.17816/brmma13051
- ID: 13051
Цитировать
Полный текст
Аннотация
В экспериментах на белых беспородных мышах, подвергнутых острому внешнему воздействию гамма- излучения, и в исследованиях на клеточной культуре А431 изучена противолучевая активность и возможный механизм фармакологического действия препаратов окисленного глутатиона. В качестве противолучевых средств исследовали глутоксим, моликсан и литан, которые вводили мышам внутрибрюшинно через 1, 24, 48 и 72 ч после облучения. Влияние дисульфидов глутатиона на состояние костномозгового кроветворения оценивали по количеству эндогенных колоний, выросших на селезенках мышей-самцов BALB/c на 9 сут после облучения, об интенсивности пролиферации клеток костного мозга и уровне биосинтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты судили по включению 3Н-тимидина. Для изучения возможных механизмов фармакологической активности дисульфидов глутатиона применяли модель in vitro с использованием специализированной клеточной культуры А431, а также оценивали содержание интерлейкина-1β, интерлейкина-4 и эпидермального фактора роста в сыворотке крови лабораторных животных. Показано, что облучение в дозе 7,3 Гр приводит к гибели 80% мышей. Применение препаратов дисульфидов глутатиона – глутоксима, литана и моликсана – в дозах 30 мг/кг в качестве средств терапии острых лучевых поражений снижает летальность облученных животных на 50–60%. Противолучевой эффект препаратов окисленного глутатиона может быть обусловлен их способностью ускорять репаративные процессы в клетках костного мозга, стимулировать продукцию зрелых клеток крови и восстанавливать функционально активную конформацию рецепторов гемопоэтических цитокинов. Препараты дисульфидов глутатиона оказывают стимулирующее влияние на рецептор эпидермального фактора роста, что проявляется в активации процессов фосфорилирования экстраклеточно регулируемых киназ 1, 2.
Полный текст
Введение. Вследствие расширения контактов с источниками ионизирующих излучений, возможности повторения аварийных ситуаций на объектах атомной энергетики, продолжения космических полетов риск переоблучения организма постоянно возрастает. Несмотря на разработку многочисленных лекарственных препаратов и биологически активных добавок для профилактики и лечения различных форм радиационных поражений, проблема поиска новых фармакологических средств противорадиационной защиты человека по-прежнему остается актуальной.
При острой лучевой болезни судьба облученного организма определяется прежде всего глубиной и длительностью лейко- и тромбоцитопении, которые, в свою очередь, зависят от величины сохранившегося после облучения пула стволовых клеток. В основе содержат окисленный глутатион и обладают способностью восстанавливать чувствительность кроветворных клеток к гемопоэтическим цитокинам [5, 10].
Цель исследования. Провести сравнительную оценку противолучевой активности фармакологических препаратов, содержащих соли окисленного глутатиона.
Материалы и методы. Эксперименты выполнены на белых беспородных мышах-самцах и линейных мышах BALB/c массой 20–22 г. При моделировании острых радиационных поражений животных подвергали общему однократному гамма-облучению на установке «ИГУР-1» при мощности дозы 1,4–1,22 Гр/мин. Доза облучения составляла 7,3 Гр, что соответствовало 80% летальной дозе при 30-суточном наблюдении (ЛД80/30). Контроль поглощенной дозы проводили с помощью дозиметра «ИД-11».
В качестве противолучевых средств исследовали глутоксим, моликсан и литан. Глутоксим является фармакологическим аналогом окисленного глутатиона. Действующее вещество глутоксима – бис-(гамма-L-глутамил)-L-цистеинил-бис-глицин динатриевая соль. Моликсан – органическая соль дисульфида глутатиона и инозина. Его действующее вещество – инозина глицил-цистеинил-глутамат динатриевая соль (рибофуранозил-гипоксантина-глицил-цистеинил-глутамата динатрия). Литан является дилитиевой солью дисульфида глутатиона. Действующее вещество литана – бис-(гамма-L-глутамил)-L-цистеинил-бис-глициндилитиевая соль. Препараты вводили мышам внутрибрюшинно через 1, 24, 48 и 72 ч после облучения.
Влияние дисульфидов глутатиона на состояние костномозгового кроветворения лабораторных животных оценивали согласно методике эндогенного колониеобразования [15] по количеству колоний, выросших на селезенках мышей-самцов BALB/c на 9 сут после облучения в дозе 7,3 Гр.
Об интенсивности пролиферации клеток костного мозга и уровне биосинтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) судили по включению 3Н-тимидина, который вводили внутрибрюшинно из расчета 1 мкКи/г массы тела за 30–40 мин до эвтаназии животных. ДНК выделяли из костного мозга бедренных костей на 3-и, 9-е и 12-е сут после лучевого воздействия. Измерение радиоактивности ДНК производили на жидкостно- сцинтилляционном счетчике «RackBeta» фирмы «LKB» (Швеция). Радиоактивность ДНК характеризовали величиной удельной активности, которую выражали в количестве импульсов/мин/мг ДНК.
Содержание провоспалительного цитокина интерлейкина-1β (IL-1β), противовоспалительного цитокина IL-4 и эпидермального фактора роста (ЭФР) в сыворотке крови животных определяли с помощью наборов для иммуноферментного анализа «ELISA» фирмы «Еndogen» (Соединенные Штаты Америки) по прилагаемым к наборам описаниям процедуры. Концентрацию цитокинов рассчитывали в пг/мл по калибровочным кривым.
Для изучения возможных механизмов фармакологической активности дисульфидов глутатиона применяли модель in vitro с использованием специализированной клеточной культуры А431. Приготовление клеточных лизатов, электрофоретическое разделение, электроперенос, иммуноокрашивание белков и удаление с мембраны связавшихся антител проводили по методике Е.Б. Буровой [4].
Полученные данные подвергали стандартной статистической обработке с расчетом среднего значения и ошибки среднего. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.
Результаты и их обсуждение. Показано, что как однократное, так и многократное (курсовое) введение глутоксима, моликсана или литана способствует сохранению жизни 60–70% облученных животных. Эффективность исследуемых веществ была практически сопоставимой.
Противолучевой эффект моликсана обусловлен ускорением репаративных процессов в клетках костного мозга и восстановлением необходимого пула кроветворных (стволовых и коммитированных) клеток костного мозга. Это подтверждается данными об увеличении почти в 2,5–3 раза количества стволовых клеток в методике эндогенного колониеобразования (табл. 1) и росту в среднем на 300% интенсивности включения меченого 3Н-тимидина в ДНК клеток костного мозга (табл. 2).
Подтверждением активации пролиферативных процессов в облученном костном мозге мышей, получавших моликсан, могут служить результаты экспериментов с 3Н-тимидином. Установлено, что у облученных животных на 3-и сут после лучевой травмы интенсивность включения 3Н-тимидина в ДНК клеток костного мозга была в 2 раза ниже, чем у необлученных животных. Однако на 9-е и 12-е сут после радиационного воздействия величина изучаемого показателя в 1,7 раза превышала его значения по сравнению с уровнем до облучения (см. табл. 2).
Таблица 1. Влияние моликсана на массу селезенки и число эндогенных колоний в селезенке мышей-самцов BALB/c на 9-е сутки после острого гамма-облучения в дозе 7,3 Гр
Показатель | Количество животных | Масса селезенки, мг | Число эндогенных колоний |
Облучение (контроль) | 17 | 42,8±3,1 | 5,7±1,1 |
Облучение + моликсан | 18 | 75,5±3,2* | 14,6±1,8* |
Примечание: * – различия по сравнению с контролем (по критерию Стьюдента), р<0,05.
Таблица 2. Влияние моликсана на интенсивность включения 3Н-тимидина в ДНК клеток костного мозга мышей-самцов BALB/c, подвергнутых острому гамма-облучению в дозе 7,3 Гр, %
Показатель | До облучения | После облучения, сут | ||
3-и | 9-е | 12-е | ||
Облучение (контроль), n=40 | 100± | 55± | 170±25 | 155±24 |
Облучение + моликсан, n=40 | 100± | 145±23* | 280±33* | 350±48* |
Примечание: * – различия по сравнению с контролем (по критерию Фишера), р<0,05.
Выявлено, что все исследуемые препараты окисленного глутатиона при курсовом применении после облучения позволяют нормализовать процессы пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток, в первую очередь миелобластов и мегакариобластов, что обеспечивает восполнение пула клеток периферической крови: не только лейкоцитов, но и тромбоцитов [1].
Согласно существующим в настоящее время представлениям, выраженность постлучевой гемодепрессии определяется состоянием систем пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток костного мозга, активность которых находится под регуляторным контролем ЭФР и IL-1β (табл. 3).
Из таблицы 3 видно, что лучевое воздействие на животных контрольной группы сопровождалось увеличением в крови содержания ЭФР и IL-1β. Так, в плазме крови животных, облученных в дозе 4,5 Гр, содержание ЭФР увеличилось по сравнению с уровнем исходных величин в 1,5–1,8 раза. Уровень IL-1β повысился при этом более чем в 2 раза. В отличие от IL-1β содержание IL-4 повышалось в крови животных на пике лучевого синдрома лишь на 25–30%.
Казалось бы, повышение уровня ЭФР и IL-1β в крови животных, подвергшихся лучевому воздействию, является благом для организма и может свидетельствовать об активации репаративных процессов. Однако клинические наблюдения свидетельствуют об обратном: параллельно с ростом в крови животных концентрации исследуемых цитокинов увеличилась выраженность проявлений гемодепрессии. Применение моликсана в качестве средства лечения острых радиационных поражений значительно уменьшало выраженность клинических проявлений радиационных гематологических расстройств и способствовало нормализации концентрации изучаемых цитокинов.
Заметим, что основным компонентом исследуемых препаратов явился окисленный глутатион (GSSG), фармакологическим аналогом которого является глутоксим. Механизмы фармакологической активности глутоксима схожи с действием ряда цитокинов, но остаются до конца не выясненными. В этой связи на клетках А431 изучалось действие глутоксима на активность рецептора ЭФР, контролируемые им транскрипционные факторы STAT1 и STAТ3, Rаs-зависимые сигнал-передающие экстраклеточно регулируемые киназы (pERK) 1, 2 в сравнении с GSSG и ЭФР.
EGFR-рецепторная тирозинкиназа проявляет сродство к ЭФР и активность при образовании димера за счет дисульфидных связей. Глутоксим и GSSG стимулируют EGFR при концентрациях 0,002–0,02 ммоль/л, что соответствует содержанию GSSG в межклеточной жидкости. Активность EGFR появляется через 5 мин после внесения исследуемых препаратов в среду инкубации и становится максимальной на 60-й мин. Действие глутоксима и GSSG на клетки сопровождается активацией pERK 1, 2, транскрипционного фактора STAT3, но не STAТ1. Активация цитоплазматических белков носит волнообразный характер и определяется на 1-й, 4-й, 8-й, 16-й и 24-й ч после инкубации. Результаты исследований указывают на способность препаратов окисленного глутатиона восстанавливать функционально активную конформацию рецепторов цитокинов и соответственно чувствительность клеток к их воздействию [2, 4], что позволяет объяснить ряд фармакологических эффектов исследуемых средств действием эндогенных цитокинов.
Таким образом, противолучевой эффект препаратов окисленного глутатиона может быть обусловлен их способностью ускорять репаративные процессы в клетках костного мозга, стимулировать продукцию зрелых клеток крови и восстанавливать функционально активную конформацию рецепторов гемопоэтических цитокинов.
В исследованиях in vitro на клеточной культуре А431 установлено, что моликсан, вносимый в инкубационную среду, вызывает стимуляцию рецептора ЭФР в течение 8 ч наблюдения. Характер активации рецептора выражается в небольшом (в среднем в 3 раза) повышении уровня фосфорилирования рецепторных белков в течение первых 5 мин с последующим снижением до контрольного значения к 30-й мин (первая волна). Затем следует возрастание активации (в среднем в 11 раз) через 1 ч с последующим снижением через 4 ч и достижением максимума через 8 ч (вторая волна).
Особый интерес представляют данные по изучению влияния моликсана на состояние внутриклеточных сигнал-передающих систем, в частности на активность pERK 1, 2, которые, по мнению M. Adachi et al. [11], G. Filomeni et al. [12], играют одну из ключевых ролей в процессах клеточной пролиферации.
Таблица 3. Влияние моликсана на содержание ЭФР, IL-1β и IL-4 в крови белых беспородных мышей-самцов, облученных в дозе 4,5 Гр, пг/мл
Показатель | До облучения | Сроки после облучения, сут | ||
3-и | 10-е | |||
ЭФР | Облучение (контроль), n=20 | 4,2±0,54 | 6,7±0,58* | 7,8±1,1* |
Облучение + моликсан, n=20 | 4,7±0,51# | 4,9±0,43# | ||
IL-1ß | Облучение (контроль), n=20 | 59,4±6,2 | 78,9±8,1* | 134,2±12,6* |
Облучение + моликсан, n=20 | 60,5±6,3# | 67,1±6,7# | ||
IL-4 | Облучение (контроль), n=20 | 23,8±2,5 | 29,9±4,1 | 33,1±4,3* |
Облучение + моликсан, n=20 | 52,5±6,3# | 60,5±6,3# | ||
Примечание: * – различия по сравнению с исходным уровнем; # – по сравнению с контролем (по критерию Стьюдента), р<0,05.
Установлено, что динамика активации pERK 1, 2 в клетках А431 при действии моликсана в целом аналогична изменению выраженности процессов фосфорилирования рецепторов ЭФР: активация pERK 1, 2 регистрировалась через 5 мин, а затем через 4–8 ч после начала инкубации. Следовательно, моликсан оказывает стимулирующее влияние на рецептор ЭФР, что проявляется в активации процессов фосфорилирования сигнал передающих белков, в частности МАР-киназ рERK 1.
Заключение. Выявлено, что глутоксим и моликсан способствуют активации процессов фосфорилирования рецепторов ЭФР, что проявляется в активации сигнал-передающих белков. Митогенактивируемый протеино-киназный каскад используется клеткой для регуляции транскрипционных генов в ответ на изменения в окружающей среде [13, 14]. В целом препараты дисульфидов глутатиона способны восстанавливать функционально активную конформацию рецепторов цитокинов и соответственно чувствительность клеток к воздействию цитокинов, что позволяет объяснить ряд их фармакологических эффектов действием эндогенных цитокинов.
Об авторах
А. Е. Антушевич
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. Н. Гребенюк
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Email: vmeda-nio@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. Г. Климов
Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
Email: vmeda-nio@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. А. Ярцева
Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
Email: vmeda-nio@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург
В. Г. Антонов
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. В. Болехан
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург
Е. Г. Богданова
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Автор, ответственный за переписку.
Email: vmeda-nio@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург
Список литературы
- Антушевич, А.А. Экспериментальное изучение лечебной эффективности литиевой соли дисульфида глутатиона в условиях острого внешнего γ-облучения / А.А. Антушевич [и др.] // Радиац. биология. Радиоэкология. – 2013. – Т. 53, № 5. – С. 451–458.
- Антушевич, А.А. Патофизиологические основы эффективности глутоксима как средства сопровождения лучевой терапии рака ротоглотки / А.А. Антушевич [и др.] // Вестн. Росс. воен.-мед. акад. – 2013. – № 3 (43). – С. 32–37.
- Бурова, Е.Б. Трансактивация рецептора эпидермального фактора роста окисленным глутатионом и его фармакологическим аналогом глутоксимом в клетках А431 / Е.Б. Бурова [и др.] // Докл. РАН. – 2005. – Т. 40, № 4. – С. 1–3.
- Бурова, Е.Б. Активация транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 при окислительном стрессе в клетках А431 включает Src-зависимую трансактивацию рецептора EGF / Е.Б. Бурова [и др.] // Цитология. – 2003. – Т. 45, № 5. – С. 466–477.
- Гребенюк, А.Н. Противолучевые свойства интерлейкина-1 / А.Н. Гребенюк, В.И. Легеза. – СПб.: Фолиант, 2012. – 216 с.
- Гребенюк, А.Н. Современные возможности медикаментозной профилактики и ранней терапии радиационных поражений / А.Н. Гребенюк [и др.] // Воен.-мед. журн. – 2011. – Т. 332, № 2. – С. 13–17.
- Рождественский, Л.М. Актуальные вопросы поиска и исследования противолучевых средств / Л.М. Рождественский // Радиац. биология. Радиоэкология. – 2013. – Т. 53, № 5. – С. 513–520.
- 8. Симбирцев, А.С. Цитокины в патогенезе и лечении заболеваний человека / А.С. Симбирцев. – СПб.: Фолиант, 2018. – 512 с.
- Солнцева, О.С. Роль цитокинов в осуществлении апоптотических процессов клеток иммунной системы у лиц, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации в малых дозах / О.С. Солнцева [и др.] // Иммунология. – 2000. – Т. 21, № 3. – С. 22–24.
- Ярцева, А.А. Экспериментальное изучение механизмов гемостимулирующей активности органической соли дисульфида глутатиона и инозина в условиях острого радиационного воздействия / А.А. Ярцева, А.Е. Антушевич, А.Н. Гребенюк // Мед.-биол. и соц.- психол. пробл. безопасности в чрезв. ситуациях. – 2016. – № 1. – С. 79–84.
- Adachi, M. Nuclear export of MAP kinase (ERK) involves a MAP kinase kinase (MEK)-dependent active transport mechanism / M. Adachi [et al.] // J. Cell Biol. – 2000. – Vol. 148, № 4. – Р. 849–856.
- Filomeni, G. Cell signaling and the glutathione redox system / G. Filomeni [et al.] // Biochem. Pharmacol. – 2002. – Vol. 64. – P. 1057–1064.
- Filomeni, G. Glutathione disulfide induces apoptosis in U937 cells by a redox-mediated p38 MAP kinase pathway / G. Filomeni [et al.] // FASEB J. – 2003. – Vol. 17. – P. 64–66.
- Fernandes, A.P. Holmgren A. Glutaredoxins: glutathione dependent redox enzymes with functions far beyond a simple thioredoxin backup system / A.P. Fernandes, A. Holmgren // Antioxid. Redox Signal. – 2004. – Vol. 6. – P. 63–74.
- Till, J.E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells / J.E. Till, E.A. McCulloch // Radiat. Res. – 1961. – Vol. 14. – P. 213–222.
Дополнительные файлы
