Using the  Paramecium caudatum  test object to determine acute toxicity of physiologically active substances

V. A. Andreev; Андреев В. А.; E. Yu. Andreeva; Андреева Е. Ю.; L. P. Erdniyev; Эрдниев Л. П.; Ya. A. Stepanov; Степанов Я. А.; A. Yu. Mikshta; Микшта А. Ю.; I. V. Mokshanov; Мокшанов И. В.; I. A. Yermolayeva; Ермолаева И. А.; N. V. Stepanova; Степанова Н. В.; V. Ya. Apchel; Апчел В. Я.

doi:10.17816/brmma25929

Using the Paramecium caudatum test object to determine acute toxicity of physiologically active substances

Authors: Andreev V.A.¹, Andreeva E.Y.², Erdniyev L.P.², Stepanov Y.A.², Mikshta A.Y.², Mokshanov I.V.², Yermolayeva I.A.², Stepanova N.V.³, Apchel V.Y.¹^,4
Affiliations:
1. S.M. Kirov Military Medical Academy
2. The 33rd Central Research and Development Test Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation
3. First Mobile Brigade of Radiation, Chemical and Biological Defense Forces (Mod Unit 71432)
4. A.I. Herzen Russian State Pedagogical University
Issue: Vol 21, No 2 (2019)
Pages: 110-113
Section: Experimental trials
URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/25929
DOI: https://doi.org/10.17816/brmma25929
ID: 25929

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

The advantage of biotesting in comparison with the physicochemical analysis of the use of Paramecium caudatum for toxicological studies has been shown. Physical and chemical analysis often fails to detect unstable compounds. In addition, these tools are not possible to determine the ultra-low concentration of chemicals. In addition to the traditional use of laboratory animals, representatives of protozoa have recently been used. In connection with this, a test object of the Simplest type was chosen and justified. The advantages of using the simplest compared with the use of laboratory animals. The various models used to test toxic substances are described. Their advantages and disadvantages are noted. The main advantages of second-order models using alternative models (various hydrobionts, bacteria, cell cultures, etc.) are described. The relevance of using the culture of cells of the ciliate Paramecium caudatum for toxicological studies has been shown. The methodological aspects of the biotesting of organic solvents using the proposed test object are presented. A unidirectional change in the toxicometric parameters of organic solvents for two types of biological objects: a white mouse and a culture of infusoria Paramecium caudatum were revealed. The possibility of using Paramecium caudatum for toxicological studies has been shown. A correlation was noted between the indicators of the general toxicity of organic dyes and those of white mice.

Keywords

ciliate Paramecium caudatum, biotesting, organic solvent, toxicometry, test objects, acute toxicity, biological models, culturing of infusoria, Lozina-Lozinsky medium, laboratory animals

Full Text

Введение. Для токсикологической оценки различных физиологически активных веществ (ФАВ) традиционно используют лабораторных животных. Однако в числе организмов, на которых проводят биотестирование, наряду с лабораторными животными зачастую присутствуют представители простейших, что тесно связывает токсикологические исследования с микробиологическими. На сегодняшний день в Российской Федерации разработано около 40 биотестов с использованием бактерий активного ила, грибов и актиномицетов, водорослей, простейших, беспозвоночных и рыб [1, 2, 5]. Наиболее яркими и распространёнными представителями простейших являются одноклеточные организмы из класса инфузорий. Применение инфузорий для проведения биотестирования можно объяснить наиболее быстрым развитием тест-реакции в ответ на воздействие химических веществ. Наступление таких реакций может происходить в диапазоне от нескольких минут до нескольких часов.

Применение биотестирования имеет ряд преимуществ перед физико-химическим анализом, средствами которого часто не удается обнаружить неустойчивые соединения или количественно определить ультрамалые концентрации химических веществ. Довольно часты случаи, когда выполненный современными средствами химический анализ не показывает наличия токсикантов, тогда как использование биологических тест-объектов свидетельствует об их присутствии в исследуемой среде. Об этом говорит значительное число методических разработок, рекомендаций и публикаций, постоянно появляющихся в специализированных изданиях, а также их широкое использование на практике. Эти методики обладают высокой чувствительностью, экспрессностью, надежностью, универсальностью и малой себестоимостью. Они просты в проведении, поддаются инструментализации и автоматизации, а их результаты легко интерпретируемы. Биотестирование дает возможность быстрого получения интегральной оценки токсичности, что делает весьма привлекательным его применение при скрининговых исследованиях [1, 5, 6, 7].

Существующая на сегодняшний день классификация биологических моделей представлена в следующем виде [2]:

– модели первого порядка – лабораторные животные;

– модели второго порядка ‒ альтернативные модели (различные гидробионты, бактерии, ферменты, культуры клеток и др.);

– модели третьего порядка – математические модели, описывающие биологические процессы.

В качестве лабораторных животных используются мыши, крысы, морские свинки, кролики, собаки, свиньи, приматы. В редких случаях исследования проводятся на крупном рогатом скоте и экзотических видах животных. Однако использование биологических моделей первого порядка сопряжено со значительными финансовыми расходами на закупку и содержание (законность приобретения и создание специализированных помещений), а также с этическими принципами проведения исследований.

В связи с этим особую значимость приобретают токсикологические исследования с использованием биологических моделей второго порядка. Исследования на биологических моделях второго порядка являются не только доступными для большинства лабораторий, но и относятся к наиболее экономически обоснованным в качестве экспресс-оценки токсикометрических показателей химических веществ на этапе доклинического изучения. С точки зрения гуманности и законности данный способ исследований не имеет отрицательного значения.

Цель исследования. Определить острую токсичность некоторых органических растворителей с использованием инфузорий Paramecium caudatum в качестве тест-объекта и возможность ее корреляции с аналогичными показателями для белых мышей.

Материалы и методы. В опытах в качестве тест-объектов использовали 10-суточную культуру настоя банановой кожуры, содержащую инфузории Paramecium caudatum и 10 белых мышей массой 16–18 г. Выбор Paramecium caudatum связан с простотой и дешевизной их культивирования, чувствительностью к токсикантам разного рода и быстрым развитием ответной реакции (табл. 1).

Оценку влияния растворителей на тест-объект проводили в микроаквариумах, в качестве которых использовали иммунологические планшеты с объемом ячейки 0,3 мл. Контроль за выживаемостью тест-объектов осуществляли при помощи цифрового микроскопа «Микрон-400» фирмы «Sititek» (рис. 1).

Рис. 1. Техническая составляющая исследований: а – иммунологический планшет; б – одноканальный дозатор; в – микроскоп «Микрон-400» цифровой

Периодическое культивирование инфузорий Paramecium caudatum осуществляется в чашках Петри. Средой для культивирования служит модифицированная среда Лозино-Лозинского. После культивирования очищали выращенную массу микроорганизмов от посторонних видов и продуктов жизнедеятельности. Для этого использовали разные способы фильтрации и разделения бактерий по разным физическим и биохимическим особенностям.

При очистке использовали нормальную физиологическую реакцию инфузорий собираться в верхних слоях жидкости (рис. 2).

Рис. 2. Сосуд с длинным горлом, в котором инфузории переместились в верхние слои жидкости

Рис. 3. Количественные значения LD₅₀ для белых мышей и LC₅₀ для инфузорий. Ряд 1 – LD₅₀ для белых мышей, ряд 2 – LC₅₀ для инфузорий

При этом задействовали сосуды с узким длинным горлом, позволяющие сконцентрировать инфузории в верхней зоне и слить их в другой сосуд с минимальным количеством загрязненной культуральной среды. Концентрат разбавляли чистой средой Лозина-Лозинского, опять собирали клетки в верхней зоне и сливали. В результате отмывания инфузорий степень разбавления культуральной жидкости чистой средой была не менее 1:200, что соответствовало рекомендациям других исследователей [5].

В 5 ячеек иммунологического планшета помещали питательную среду с тест-объектами в объеме 0,15 мл и при помощи микроскопа визуально определяли наличие и активность инфузорий. После этого в ячейки добавляли рабочие растворы исследуемых веществ в различных концентрациях в объеме 0,15 мл. Визуальное наблюдение за тест-объектами осуществляли в течение суток. Определяемым токсикометрическим параметром являлся показатель смертности тест-объекта при воздействии растворителя в заданной концентрации (LC50, мг·л–1). В работе придерживались методических рекомендаций по практическому использованию стандартизованных тест-культур [5]. Острое токсическое действие исследуемой пробы определяли по смертности инфузорий за определенный период экспозиции. Критерием острой токсичности пробы служила гибель 50% и более клеток за 24 ч. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Таблица 1. Наиболее распространенные тест-объекты и критерии их выбора

Вид тест-объекта	Критерий выбора
Вид тест-объекта	чувствительность к токсикантам разного рода	простота культивирования и дешевизна использования	время развития тест-реакции	качество потомства
Дафнии	+	+	До 96 ч	Отрицательное
Половые клетки	-	-	До 7 ч	Отрицательное
Люминесцентные бактерии	-	-	До 7 ч	Отрицательное
Инфузории Paramecium caudatum	+	+	От 10 до 15 мин	Отрицательное

В качестве контроля использовали культуральную среду с инфузориями. При этом в контроле гибель особей не превышала 10%. По окончании срока наблюдения регистрировали токсикометрические показатели исследуемых растворов органических растворителей. Заражение белых мышей проводили per os с последующим определением их 50% гибели (LD50, мг·кг–1).

Результаты и их обсуждение. Установлено,что токсичность органических растворителей для инфузорий и белых мышей имеет однонаправленное увеличение в ряду: диметилсульфоксид (ДМСО)→ацетон→спирт этиловый→диметилфорамамид (ДМФА) (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительная характеристика показателей токсичности органических растворителей для белых мышей и инфузорий Paramecium caudatum

Органический растворитель	LD50 для белых мышей при внутрижелудочном введении, мг·кг–1	LC для инфузорий, мг·мл–1 50
ДМСО	21,18	43,7
Ацетон	9,3	7,49
Спирт этиловый	8,7	6,4
ДМФА	6,8	4,36

Полученные результаты свидетельствуют об общей направленности изменения токсикометрических показателей органических растворителей для двух видов биологических объектов: белая мышь и инфузории Paramecium caudatum. Это подтверждает выбор и обоснованность предлагаемой нами биомодели для проведения токсикологических исследований. Кроме того, процесс подбора оптимального растворителя для постановки экспериментов на инфузориях может быть упрощен за счет имеющихся баз данных по показателям токсичности для лабораторных животных.

Гибель клеток инфузорий является наиболее надежной реакцией выявления токсических свойств различных веществ. Однако при исследовании низких концентраций токсических веществ могут выявляться и другие тест-функции, такие как скорость размножения, длина свободного пробега, хемотаксис, двигательная активность [3, 4, 6, 7].

Изменение подвижности – ориентировочный параметр при оценке токсичности, так как на движение у простейших расходуется всего 1% энергии общего обмена, следовательно, эта функция незначительно отражает изменения метаболизма клетки при его нарушениях токсичными агентами. Большей чувствительностью обладает биотест на основе оценки скорости размножения.

Выводы

Культура клеток инфузории Paramecium caudatum представляет собой адекватный тест-объект для выявления острой токсичности веществ, и ее использование возможно для проведения токсикологических исследований.

Показатели острой токсичности органических растворителей, выявленные на культуре Paramecium caudatum, в целом коррелируют с аналогичными показателями для белых мышей.

About the authors