Изготовление тканеинженерного бесклеточного матрикса пуповины человека

Полный текст

Введение. Создание in vivo функционирующих тканей для замены утраченных или поврежденных с целью трансплантации их пациенту - динамично развивающаяся область медицины, именуемая тка- невой инженерией. В основе ее лежит получение бесклеточного матрикса, заселяемого клетками с регенераторными свойствами, итогом деятельности которых будет замена трансплантированных времен- но функционировавших структур вновь синтезирован- ными компонентами собственных восстановленных тканей [4, 5]. Внеклеточный (бесклеточный) матрикс (ВКМ) - биологическая трехмерная конструкция, обладаю- щая свойствами сохранять свою пространственную организацию и обеспечивающая транспорт клеток и различных биологических молекул [19]. Материал на основе естественного ВКМ должен быть биосовме- стимым, иммунологически инертным, способным к продолжительному функционированию и биодегра- дируемым в перспективе, предоставляя засеянным перед трансплантацией или резидентным клеткам сайты для прикрепления, пролиферации, созревания и функционирования [14, 18, 21]. Одним из вариантов создания биомиметической, неиммуногенной, безопасной и эффективной кон- струкции на основе ВКМ является процесс децеллю- ляризации, заключающийся в удалении клеточных компонентов из соответствующих тканей [4, 7, 10]. Наиболее труднопреодолимым препятствием на пути создания тканеспецифичных конструкций является ограниченность донорского материала. Коммерческие продукты, представленные в на- стоящее время на мировом рынке клеточных техно- логий и тканевой инженерии, в большинстве своем изготовлены из тканей животных или трупных тканей человека [18]. В эксперименте исследуют биоматери- ал хитозан, фиброин шелка (продукты деятельности насекомых) и бесклеточную кожу рыб для создания тканеинженерных конструкций. Но ксеногенные био- материалы создают проблемы из-за иммунологиче- 124 1 (69) - 2020 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования ских реакций и риска передачи возбудителя, в том числе прионной инфекции [5, 11]. В Российской Феде- рации в соответствии с Федеральным законом № 180 [3] для трансплантации разрешены биомедицинские продукты из биоматериала человека, полученного как при жизни, так и после его смерти. Однако ни прижизненный, ни кадаверный биома- териал взрослого донора не оптимален, поскольку его состав, структура тканей и органов подвергались изменениям в течение его жизни, в том числе и из-за заболеваний [11, 19]. Процедура удаления клеток из тканей взрослого донора может еще более усугубить повреждение матрикса. Итогом влияний факторов внешней и внутренней среды на ткани донора может оказаться утрата важных молекул, необходимых для прикрепления, расселения и функционирования кле- ток. В отличие от взрослой ткани, ВКМ из ткани плода или новорожденного содержит больше незрелого коллагена с небольшим количеством сшивок, что способствует более эффективному ремоделированию ткани. Поэтому ожидаемо, что ВКМ, полученный из ткани плода или новорожденного, будет индуцировать более эффективную и конструктивную ткань [11]. Пуповина, происходящая из внезародышевой мезодермы, содержит особую твердую слизистую соединительную ткань, так называемый Вартонов студень, который окружает сосуды плода и, как по- лагают, предотвращает сжатие, скручивание и сгиба- ние. Вартонов студень характеризуется различными типами коллагена и аморфной массой вещества, компонентами которой являются гликозаминогликаны (гиалуронан, хондроитин сульфат, гепарин, гепаран сульфат) и протеогликаны [5, 15, 21]. Доказательством критической роли этих молекул в онтогенезе является то, что пуповина в своем благополучном развитии выполняет важнейшую функцию предотвращения сдавления сосудов пуповины и угрозы гипоксии плода даже при образовании узлов (рис. 1). Мутации с утратой белков ВКМ, таких как фибро- нектин, ламинин, или коллаген, являются летальными для эмбриона [2]. В отличие от узлов пуповины, де- Рис. 1. Двойной узел пуповины. 29-летняя женщина с неосложненной беременностью в срок родила младенца массой 3,7 кг, шкала Апгар составила 8 и 9 баллов на первую и пятую минуты. Пуповина имела сложный узел. Узлы, подобные этому, редки, и их связь с асфиксией плода не доказана. Младенец находился в хорошем состоянии, без каких-либо проявлений асфиксии (цит. по: [6]) фекты пуповины с нарушением структуры и состава Вартонова студня приводят к нежизнеспособности плода и новорожденного (рис. 2). Провизорные органы - пуповина и плацента, имея мезодермальное внеэмбриональное происхождение, сохраняют особенности эмбрионального фенотипа, проявляющиеся в быстрой регенерации поврежде- ний ткани. Эта способность обеспечена ростовыми факторами, среди которых доминируют молекулы трансформирующего фактора роста TGF-β3 над при- сущими тканям взрослого организма TGF-β1,2; преоб- ладанием незрелого коллагена над зрелым с малым количеством коллагеновых сшивок; гиалуронаном высокой молекулярной массы в противовес низкомо- лекулярному постнатальных тканей; особенностями цитокиновой регуляции (доминирование у плода противовоспалительного интерлейкина-10 над про- воспалительными интерлейкинами-6, -8); особенно- стями клеточных популяций в фетальных тканях: пре- обладанием фибробластов над миофибробластами, малым количеством тучных клеток и макрофагов [13]. Упомянутые особенности тканей плода дают ос- нование предполагать, что матрикс, полученный из ВКM провизорных органов, сможет обеспечить ин- дуктивное микроокружение для образования тканей в месте его трансплантации. Сохранность в децел- люляризированном матриксе всех его компонентов - фибриллярных и неструктурных коллагенов, глико- заминогликанов, протеогликанов - представляется необычайно важной. Поэтому пристальному анализу были подвергнуты описанные в литературе протоко- лы, в которых применены жесткие физические (цен- трифугирование на больших скоростях) и химические Рис. 2. Младенец массой тела 2500 г родился на 38 неделе беременности в среднетяжелом состоянии (оценка по шкале Апгар на 1 и 5 минутах составляла 4 и 5 баллов соответственно). Осмотр пуповины показал отсутствие Вартонова студня вокруг пупочных артерий. В течение часа с момента рождения у ребенка развился дистресс- синдром, он умер вскоре после рождения. Четыре случая отсутствия Вартонова студня вокруг артерий пуповины, упомянутые в этом исследовании, сопровождались компрессией незащищенных сосудов и перинатальной смертью (цит. по: [12]) ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 1 (69) - 2020 125 Экспериментальные исследования методики получения матрикса (использование агрес- сивных органических кислот, химического сшивания коллагена, а также нефизиологических параметров ферментативного гидролиза) [9, 16]. Механические свойства получаемых матриксов пуповины зависят от сохранности структур ВКМ, это еще один фактор регенеративного фенотипа плода. Повышенная жесткость матрикса in vitro приводит к увеличению превращения дермальных фибро- бластов в фенотип миофибробластов и усилению экспрессии ими генов синтеза коллагенов COLIA1, профибротических факторов роста TGF-β1 и TGF-β2, экспрессии альфа-гладкомышечного актина - то есть спектра факторов роста и структурных волокон матрикса, присущего постнатальному фенотипу. Осо- бые механические свойства и композиция каркаса внеэмбриональных структур могут быть решающими характеристиками при создании бесклеточной ткане- инженерной конструкции. Процедура удаления клеток из ткани пуповины в идеале должна сохранять все многообразие структурных и неструктурных молекул и минимальное количество сшивок между волокнами коллагена. Применяемые методики децеллюляризации классифицируются на физические, химические, биологические/ферментативные или сочетающие эти подходы [13], в основе которых лежит общий принцип разрушения клеточной мембраны и удале- ния клеточного содержимого [4, 7]. Физическими методиками являются центрифугирование, циклы замораживания-оттаивания, обработка ультразву- ком [10, 20]. Химические методики - использование кислот и щелочей, гипертонических и гипотонических растворов, ионных, неионных и цвиттерионных де- тергентов, хелатирующих агентов [11, 17]. Наиболее часто используют додецилсульфат натрия (SDS), дезоксихолат натрия и тритон Х-100 или Х-200 [2]. При ферментативной децеллюляризации используют пепсин, трипсин, эндо- и экзонуклеазы [8]. Выбор действующего агента, метода децеллюля- ризации и продолжительности воздействия зависит от ряда факторов, в частности от характеристики ткани (количественное содержание клеток и различ- ных биологических молекул, ее плотность и толщина) и клинических целей [7]. Так, для удаления клеток в образцах толщиной до нескольких миллиметров ткань подвергается кратковременному воздействию гипотонических или гипертонических растворов, ферментов и/или детергентов, последующему отмы- ванию в сопровождении разнообразных физических процессов [4, 5]. Более толстые ткани (например, хря- щевые) требуют более энергичного биохимического воздействия и многократной отмывки от нескольких часов до нескольких дней [1]. Действующий агент, методика и продолжительность процесса удаления клеток влияют на состав ВКМ и вызывают некоторую степень разрушения ультраструктуры [10]. ВКМ тканей плода и новорожденного, включая пуповину, содержит значительно большее количество сульфатированных гликозаминогликанов, чем любые постнатальные ткани. Хондроитин сульфат, гепарин, гепаран сульфат и несульфатированный гиалуронан фиксируют цитокины и факторы роста. Поэтому про- токол децеллюляризации пуповины должен быть оп- тимизирован для сохранения важных регенераторных молекул с учетом высокой гидрофильности гликоза- миногликанов, требующей существенного увеличения продолжительности отмывки материала от агентов. Эффективное удаление внутриклеточных ком- понентов и антигенных эпитопов стало решающим вопросом из-за необходимости минимизации нега- тивных иммунных реакций реципиента, порожденных аллогенными скаффолдами. Минимальными крите- риями качественной децеллюляризации, которым следуют во всем мире, являются: 1) количественное содержание дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) менее 50 нг/мг в сухой ткани; 2) содержание фраг- ментов ДНК размером менее 200 пар нуклеотидов; 3) отсутствие ядерного материала в тканевых срезах при окрашивании 4,6-диамидино-2-фенилиндолом или гематоксилином и эозином. Соблюдение этих критериев приводит к эффективности скаффолдов в модельных системах in vivo [7]. Физические методики - дифференцированное центрифугирование при разных скоростях - оказы- ваются эффективными для выделения отдельных компонентов ВКМ, так исследователи получали глико- заминогликаны, при этом клетки оказывались вместе с коллагенами в удаляемом осадке [20]. Ультразвук, воздействовавший на биоматериал в процессе оттаивания, приводит к значительному уменьшению клеток в матриксе гортани, однако вы- зывает структурные повреждения скаффолда [10]. Химические методики [17] применяют для полу- чения коллагенов I и IV типов из плаценты путем деструктивного воздействия на биоматериал орга- нических кислот, не только разрушающих клетки, но и гидролизующих белки матрикса. Высокая концентрация гликозаминогликанов в биоматериале пуповины не только требует оптими- зации протокола децеллюляризации, но и изменяет механические свойства полученных жидких форм ВКM [14]. Действительно, ВКМ пуповины выявил высокую скорость гелеобразования по сравнению с ВКМ из постнатальных органов свиньи с низким содержанием гликозаминогликанов [11]. При центрифугировании на больших скоростях низкомолекулярный гиалуронан оказывается в отбрасываемом супернатанте, поэтому методика используется для получения гликозамино- гликанов низкой молекулярной массы [4, 16, 21]. Существенной особенностью ВКM из постнаталь- ных тканей является их сжатие при фибробластопо- добном культивировании. Сокращение гелеобраз- ного ВКМ пуповины человека при культивировании фибробластов происходит существенно медленнее, чем ВКМ тканей животных [18]. Это наблюдение со- гласуется с тем, что трехмерный матрикс Вартонова студня имеет меньшую жесткость пространственной 126 1 (69) - 2020 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования структуры, чем жесткость постнатального матрикса. ВКМ пуповины избирательно способствует рас- пространению мезенхимальных стволовых клеток (МСК) по сравнению с другими типами ВКM, является превосходным фидером для культивирования МСК для нужд рецеллюляризации тканеинженерных кон- струкций таргетных органов или клеточной терапии [18]. Dan P. et al. [8] представили ферментативный спо- соб получения ВКМ из Вартонова студня трипсином, а трипсиновую реакцию ингибировали бычьей сыво- роткой. Однако применение сывороток животного происхождения при работе с пуповиной человека может стать источником прионных инфекций, а по- тому не применимо при создании тканеинженерных конструктов для трансплантации человеку [3]. Альтернативным вариантом получения внекле- точного матрикса является непосредственное его создание клетками Вартонова студня с последующим удалением клеток-продуцентов. В течение 7-9 дней на стеклянных планшетах в ростовой среде, дополненной аскорбиновой кислотой для стимулирования обра- зования ВКМ, были культивированы МСК пуповины человека. Для децеллюляризации материала образцы обработали растворами неионных детергентов (три- тон X-100) и ферментов (дезоксирибонуклеаза) [19]. Однако в литературе не найдено описаний создания in vitro трехмерного матрикса пуповины путем культи- вирования клеток-продуцентов. Наиболее часто целью исследователей является получение отдельных компонентов ВКМ пуповины [16, 20]. Испанские изобретатели Perez J.F. et al. [16] извлекали из ВКМ пуповины сульфатированные и не- сульфатированные гликозаминогликаны с помощью продолжительного ферментативного расщепления, затем их подвергали химическому сшиванию. Матрикс приобретал твердую трехмерную пористую структуру. При всей привлекательности описанного протокола многие его этапы не физиологичны и не сохраняют в итоге природных свойств исходного материала, в частности, способствуют созданию монокомпонент- ного бесколлагенового матрикса большей жесткости. Xiao T. et al. [20] после пятикратного замораживания- оттаивания гомогената подвергали его дифферен- циальному и градиентному центрифугированию, а полученный супернатант содержал преимущественно гликозаминогликаны. В других исследованиях описана процедура получения только коллагенов определен- ного типа [17]. Цель исследования. Обосновать и воспроизве- сти оптимальный протокол удаления клеточного ма- териала из Вартонова студня пуповины человека для создания тканеинженерного бесклеточного матрикса. Материалы и методы. Для децеллюляризации пуповины и подготовки внеклеточных матриксов бра- ли пуповины человека от здоровых доношенных ново- рожденных после самопроизвольных родов с инфор- мированным согласием доноров и с использованием руководящих принципов, утвержденных этическим комитетом при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, № 203. Все доноры пуповины проходили серологические исследования на наличие инфици- рования вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), цитомегаловирусом, вирусом гепатита типа A, B, и сифилисом. Фрагменты пуповины замораживали (>16 ч при -20°C), асептически переносили в лабораторию, размораживали и ажитировали в 0,1 М фосфатном бу- ферном растворе (PBS) фирмы «Биолот» (Россия) при 120 об/мин и комнатной температуре. PBS меняли от трех до пяти раз, прежде чем пуповину препарировали в ламинарном шкафу для удаления сосудов. Вартонов студень пуповины измельчали, а затем гомогенизиро- вали с помощью прибора «gentleMACSTM Dissociator» фирмы «Milteniy Biotec» (Германия). Децеллюляризацию гомогенизированного Вар- тонова студня осуществляли детергентным спосо- бом с использованием стерильного 0,05% раствора SDS фирмы «Unger» (Норвегия) в течение 24 ч при комнатной температуре и шейкировании при 120 об/мин. По окончании децеллюляризации образцы подвергали многократной отмывке PBS (рН=7,42) с целью удаления SDS и открепившихся клеток. Де- целлюляризированный матрикс хранили в растворе пенициллина-стрептомицина (100 МЕ/мл и 100 мкг/ мл соответственно) фирмы «Биолот» (Россия). Для предварительного и быстрого выявления клеток препараты окрашивали 2% раствором аце- тоорсеина. Препараты анализировали и документи- ровали в видимом проходящем свете на микроскопе «AxioImager» 2M, объективы EC Plan Neofluar, камера цветная Axiocam MRC5 фирмы «Carl Zeiss» (Германия). В соответствии с общепринятыми методиками от- сутствие ядер клеток в децеллюляризованных тканях документировали окрашиванием с помощью флуорес- центного красителя 4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 1:1000 Invitrogen) фирмы «Paisley» (Украина). Концентрация DAPI в рабочем растворе - 0,01 мг/ мл. Препараты анализировали и документировали с использованием флуоресцентного микроскопа «AxioImager 2M» фирмы «Carl Zeiss» (Германия). Количественный анализ ДНК проводили с исполь- зованием коммерческого экстрактивного набора «In- staGene matrix» фирмы «BioRad» (Соединенные Штаты Америки). Двухцепочечную ДНК выделяли из нативных и децеллюляризованных тканей в соответствии с ин- струкциями производителя. Оптическую плотность экстракта ДНК измеряли путем абсорбции при 260 нм на спектрофотометре «Implen NanoPhotometer NP80 Touch» фирмы «GmbH» (Германия). Для каждого на- тивного и децеллюляризованного образцов анализ повторяли 3 раза. Для статистической обработки данных использова- ли пакет StatSoft Statistica 6.1. В случае распределе- ния признака, отличного от нормального, результаты представляли в виде медианы, 25 и 75 перцентилей: Ме (Р25-Р75). Анализ достоверности различий уровня концентрации ДНК в нативном биоматериале и после ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 1 (69) - 2020 127 Экспериментальные исследования проведения децеллюляризации ткани осуществляли с использованием непараметрической статистики (критерий Вилкоксона), за критический уровень зна- чимости принимали значение р<0,05. Результаты и их обсуждение. В проведенном исследовании сделана попытка получить полноком- понентный внеклеточный матрикс из ткани пуповины, не прибегая к изоляции гликозаминогликанов и/или коллагенов, а лишь удаляя клеточный материал. Пуповины (рис. 3) препарировали в ламинарном шкафу с соблюдением правил асептики с удалением вены и артерий. Вартонов студень вместе с мембраной подвергали размельчению и гомогенизации, а затем шейкировали в растворе SDS в течение 24 ч. Качество децеллюляризации оценивали с помо- щью световой микроскопии (рис. 4, 5). Гистологические исследования показали, что по- сле децеллюляризации ядер в биоматериале почти не наблюдается. С целью оценки качества отмывки открепленных клеток и ядерного материала из ткани определяли содержание ДНК в нативном биоматериале пуповины и после его децеллюляризации. Среднее содержание ДНК в гомогенизированном биоматериале нативной пуповины составило 468,75 (453,65-475,15) нг/мкл, после децеллюляризации - 29,2 (27,8-30,7) нг/мкл. После децеллюляризации содержание ДНК досто- верно снижено, p<0,001 (рис. 6). Как следует из рисунков 4-6, примененный в на- шем исследовании щадящий способ удаления клеток раствором SDS в той концентрации, при которой не происходит разрушения матриксных белков, является весьма эффективным, поскольку полученный биома- териал содержит крайне мало клеток и минимальное количество ДНК. Использованный способ устранения клеток из ткани пуповины, очевидно, не единственный, и, по- мимо критерия бесклеточности, эффективность наиболее оптимальной методики будет определяться также сохранностью состава ВКМ (фибриллярные и неструктурные типы коллагена, сульфатированные и несульфатированные протеогликаны, факторы ро- ста). Выявление характеристик, свидетельствующих о сохранности бесклеточного матрикса, - предмет дальнейших экспериментов. Разные типы коллагенов, составляющие 75-80% матрикса пуповины и определяющие его простран- ственную структуру, обладают той специфической а б Рис. 3. Пуповина (а), выделение Вартонова студня (б) а б Рис. 4. Нативная пуповина: а - окраска ацетоорсеином; б - окраска DAPI, для всех ок. Р1 10×/23, об. EC Plan Neofluar 10×/0,3, шкала 100 мкм 128 1 (69) - 2020 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования а б в Рис. 5. Децеллюляризированная пуповина: а - окраска DAPI, ок. Р1 10×/23, об. EC Plan Neofluar 10×/0,75; шкала 100 мкм; б - окраска DAPI, ок. Р1 10×/23, об. EC Plan Neofluar 40×/0,3; в - окраска орсеином, ок. Р1 10×/23, об. 20/050, шкала 50 мкм Рис. 6. Содержание ДНК в нативном (вверху) и децеллюляризированном (внизу) Вартоновом студне пуповины человека особенностью, что они лишены поперечных сшивок, и в этом их, на наш взгляд, ценность. Поэтому основной научный интерес нашего исследования заключен в поиске оптимального протокола децеллюляризации, позволяющего сохранить состав нативного ВКМ пу- повины. Заключение. Терапевтический успех тканеинже- нерных конструкций на основе ВКМ будет зависеть не только от биоактивности, но и от сохранности структурных и механических характеристик биомате- риала. В процедурах децеллюляризации провизорных тканей человека важны щадящие по отношению к компонентам ВКМ этапы удаления клеток, использо- вание для иммобилизации ферментов нексеногенных сывороток, тщательная отмывка клеточного дебриса, качественный процесс удаления использованных ре- активов, применение антибиотиков на этапах децел- люляризации и надежная стерилизация полученного продукта, а также возможность хранения конечного продукта. Ограничения этого исследования заключа- ются в том, что протокол не был оценен в отношении сохранности структур бесклеточного матрикса. Тем не менее, результаты, представленные в нашем ис- следовании, обнадеживают, и эту методику можно считать полезной основой для многих других проце- дур децеллюляризации.

Об авторах

Л И Калюжная

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

В Е Чернов

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

А С Фрумкина

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

С В Чеботарев

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

Д А Земляной

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Санкт-Петербург

Д В Товпеко

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

А В Косулин

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы