Experimental evaluation of the effectiveness of adipogenic mesenchymal stem cells for the treatment of skin burns of III degree

E. V. Zinovev; Зиновьев Е. В.; V. N. Tsygan; Цыган В. Н.; M. S. Asadulaev; Асадулаев М. С.; V. E. Yudin; Юдин В. Е.; R. G. Stoyanovsky; Стояновский Р. Г.; N. V. Smirnova; Смирнова Н. В.; A. S. Shabunin; Шабунин А. С.; S. A. Lukyanov; Лукьянов С. А.; T. A. Shalonya; Шалоня Т. А.; D. V. Kostyakov; Костяков Д. В.

Экспериментальная оценка эффективности применения адипогенных мезенхимальных стволовых клеток для лечения ожогов кожи III степени

Авторы: Зиновьев Е.В.¹, Цыган В.Н.¹, Асадулаев М.С.², Юдин В.Е.³, Стояновский Р.Г.², Смирнова Н.В.³, Шабунин А.С.³, Лукьянов С.А.², Шалоня Т.А.², Костяков Д.В.¹
Учреждения:
1. Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
2. Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
3. Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого
Выпуск: Том 19, № 1 (2017)
Страницы: 137-141
Раздел: Экспериментальные исследования
Статья получена: 16.11.2023
Статья одобрена: 16.11.2023
Статья опубликована:
URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/623483
ID: 623483

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Приведены результаты применения мезенхимных адипогенных стволовых клеток, а также разрабатываемых перспективных раневых покрытий на основе нановолокон хитозана и сополиамида, коммерческого гистеобиопластического материала на основе гидрогеля гиалуроновой кислоты при лечении ожогов кожи III степени в эксперименте. Исследование проведено на 32 самцах крыс линии Wistar-Kyoto массой 230–250 г. Для выполнения работы в ходе первого этапа исследования была разработана оригинальная методика для воспроизведения термического ожога кожи у мелких лабораторных животных (грызунов). Приведены подробные схемы приборов, используемых в эксперименте. Консервативное лечение ран животных дополняли хирургическим компонентом в виде ранних некрэктомий. Установлено, что применение адипогенных мезенхимных стволовых клеток позволяет снизить частоту развития гнойных осложнений, а также способствует сокращению сроков восстановления кожного покрова на 24,5%, но не позволяет достичь результата, констатируемого после выполнения ранних некрэктомий и замещения дефектов гистеопластическими материалами на основе природных полимеров. Доказано, что использование покрытий на основе гидрогеля гиалуроновой кислоты улучшает кровоснабжение новообразованной грануляционной ткани в области дефекта за счет увеличения числа сосудов микроциркуляторного русла на 46,2%. Установлено, что инъекционное и инфильтрационное введение адипогенных мезенхимальных стволовых клеток уже к 21 суткам эксперимента позволяет добиться увеличения толщины грануляций на 66%. Показано, что анализируемые раневые покрытия позволяют достоверно ускорить процессы репаративной регенерации и гистеогенеза в зоне термического ожога кожи после некрэктомии на 14,6–46%.

Ключевые слова

глубокие термические ожоги кожи, раневые покрытия, восстановление кожного покрова, мезенхимальные стволовые клетки, алифатический сополиамид, хитозан, нанофибриллы хитина, гидрогель гиалуроновой кислоты

Полный текст

Введение. Современные способы лечения глубоких термических ожогов кожи не позволяют добиваться излечения пострадавших с критическими поражениями, оставляя ряд нерешенных вопросов, прежде всего в плане выбора быстрой и эффективной методики восстановления кожного покрова при таких поражениях [1–4]. Одним из возможных путей улучшения результатов лечения, повышения эффективности способов восстановления кожного покрова пациентов с обширными глубокими ожогами является использование методов биотехнологии, в частности применение с этой целью адипогенных мезенхимальных стволовых клеток [5–7, 9–12].

Цель исследования. Изучить влияние мезенхимальных стволовых клеток и экспериментальных раневых покрытий на репаративный гистогенез при глубоких ожогах кожи.

Материалы и методы. Экспериментальная работа выполнена на 32 самцах крыс линии Wistar-Kyoto массой 230–250 г. Животные были разделены на 4 равные группы с учетом способа лечения. В 1-й группе лечение экспериментальных ран проводили с использованием адипогенных мезенхимальных стволовых клеток. Во 2-й и 3-й группах на дефекты укладывали раневые покрытия на основе алифатического сополиамида и хитозана и гидрогеля гиалуроновой кислоты. Лечение ожоговых ран в 4-й группе животных не проводилось. Воспроизведение ожога кожи III степени (МКБ-10) осуществляли по собственной оригинальной разработанной методике (рационализаторское предложение Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова № 14287/1 от 19.01.2016 г.). После подготовки операционного поля животное фиксировали к лабораторному столу. Разметку площади ожога осуществляли трафаретом площадью 32 см2 (20% площади тела крысы). На депилированной коже спины животного датчиком электротермопары мультиметра «Electroline» (Китай) определяли температуру кожи и металлической пластины, нагреваемой через резистивный нагревательный элемент (рис. 1–2). Время экспозиции – 10 с при температуре на поверхности кожи 95–97 Со (рис. 3).

Рис. 1. Схема нагревательного элемента для воспроизведения термического ожога: 1 – нагревательный элемент, 2 – терморегулятор, 3 – резистор, 4 – лампа индикатора, 5 – сетевая вилка

Рис. 2. Схема термопары для дозировки высокотемпературного воздействия: 1 – измерительный прибор, 2 – соединительные провода, 3,4 – термоэлектроды

Рис. 3. Кожа крысы после воспроизведения ожога III степени

В 1-й группе животных спустя 60 мин после ожога III степени проводили местное инъекционное и инфильтрационное (5 мл клеточной суспензии, содержание клеток 1 миллион в 1 мл) введение стволовых клеток в подлежащую под струпом жизнеспособную ткань без предшествующей некрэктомии (рис. 4).

Рис. 4. Этап введения суспензии стволовых клеток в область ожога кожи III степени

Аллогенные стволовые клетки получали из подкожно-жировой клетчатки крыс. Отбор осуществлялся под наркозом с соблюдением правил асептики. Для этого в области передней брюшной стенки выполняли 2–3 вертикальных разреза, из которых инструментально извлекали 1–2 г подкожно-жировой клетчатки (рис. 5). Рану зашивали узловыми швами.
Выделение и культивирование стволовых клеток проводили в лаборатории полимерных материалов для трансплантологии и тканевой инженерии Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого (СПб ПУ).

Рис. 5. Этапы отбора подкожно-жировой клетчатки для выделения мезенхимальных стволовых клеток

Во 2-й и 3-й группах животных спустя 60 мин после травмы под общим ингаляционным (эфирным) наркозом в асептических условиях выполняли радикальную некрэктомию до фасции и аппликацию раневых покрытий на основе природных полимеров (рис. 6).

Рис. 6. Раневая поверхность после выполнения некрэктомии

Во 2-й группе лечение ран осуществлялось с использованием экспериментальных раневых покрытий на основе алифатического сополиамида и хитозана производства СПБ ПУ (рис. 7).

Рис. 7. Апликация раневого покрытия на основе алифатического сополиамида и хитозана

В 3-й группе раневую поверхность замещали раневыми покрытиями на основе гидрогеля гиалуроновой кислоты производства Общества с ограниченной ответственностью ДЖИ-групп (рис. 8). Их дополнительную фиксацию осуществляли кожным клеем «Dermabond» (Германия).

Рис. 8. Фиксация раневого покрытия на основе гидрогеля гиалуроновой кислоты

В 4-й группе (контроля) лечение ран животных не осуществляли.
Оценку эффективности избранных методик лечения и фотографирование ран проводили через каждые трое суток. Выполняли осмотр ран, отмечали характер отделяемого, наличие и вид грануляций, фиксировали сроки отторжения струпа и заживления раневых поверхностей. Площадь раны и индекс заживления вычисляли по формуле:

$\frac{(S - S_{n}) \times 100}{S \times T}$ ,

где S – площадь раны при предыдущем измерении, мм2; $S_{n}$ – площадь раны при данном измерении, мм2; T – интервал между измерениями, сут.
Отбор биоптатов для гистологического исследования осуществляли на 3-и, 7-е, 12-е, 15-е, 21-е, 28-е сутки лечения. Биоптаты фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина с последующей проводкой через спирты восходящей концентрации (30–100%) и заливкой в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином с дальнейшим их исследованием, используя светооптическую микроскопию.
Обработка полученных результатов проводилась в соответствии с общепринятыми методами вариационной статистики. Критерием достоверности считали величину p<0,05.
Результаты и их обсуждение. Установлено, что у животных 1-й группы в процессе регенерации зоны глубокого ожога III степени при использовании адипогенных мезенхимальных стволовых клеток на 21 сутки площадь раны уменьшилась до 5,7 см2 (p<0,05). Применение адипогенных мезенхимальных стволовых клеток на 28-е сутки наблюдения позволило ускорить процессы регенерации на 24,5% и уменьшить площадь рубца на 68,7% по сравнению с 4-й группой (рис. 9, табл. 1).

Рис. 9. Динамика площади ожоговой раны с учетом способа лечения

Таблица 1

Планиметрическая оценка ран с учетом методик лечения

Группа	Срок заживления, сутки	Площадь рубца, см2
1-я	34±2,1**	2,5±1,2
2-я	24±1,1*	5±2,3
3-я	38±1,6**	3,8±1,7
4-я	45±1,8**	8±1,9

Примечение: * – различия по сравнению с животными 4-ой группы; ** – различия по сравнению со 2-й группой, p<0,05.

Выполнение радикальной хирургической некрэктомии в зоне глубокого ожога кожи и последующее использование раневых покрытий на основе алифатического сополиамида и гиалуроновой кислоты оказалось более эффективным. При замещении дефекта покрытием из хитозана и сополиамида к исходу третьей недели исследования у животных 2-й группы отмечено сокращение площади раны до 1,5 см2. На 28 сутки наблюдения по сравнению с группой контроля констатировано ускорение процессов регенерации на 46,7%, а также сокращение площади рубца на 37,5%. Наилучшие результаты для закрытия ран после некрэктомии получены при использовании покрытия на основе гиалуроновой кислоты. К исходу третьей недели исследования в 3-й группе животных отмечено сокращение площади раны до 8 см2, на 28 сутки наблюдения по сравнению с группой контроля констатировано ускорение процессов регенерации на 15,6%, а сокращение площади рубца на 52,5%. К этому сроку наибольшая площадь дефекта (7,8 см2) отмечалась в контрольной группе животных, лечение которых не проводилось.
Число сосудов микроциркуляторного русла в биоптатах ран к исходу 21-х суток наблюдения оказалось на 46,2% больше в 3-й группе животных, раны которых после предварительной хирургической некрэктомии покрывали биоптатом на основе гидрогеля гиалуроновой кислоты. Число микрососудов в растущих грануляциях на фоне введения стволовых клеток не имело отличий от контрольной группы (рис. 10).

Рис. 10. Число микрососудов в поле зрения с учетом способа лечения

На 21 сутки наблюдения установлено, что в 1-й группе животных толщина новообразованной грануляционной ткани в области дефекта наибольшая – 2002 мкм (в 1,8 раз больше, чем в 4-й группе (p<0,01)). Это превышает на 17 и 37% толщину новообразованных грануляций во 2-й и 3-й группах животных соответственно (табл. 2).

Таблица 2

Толщина новообразованных грануляций с учетом способа лечения

Группа	Толщина ткани, мкм
1-я	2002,1±63,5, , **
2-я	1676,2±67,1*
3-я	1273,4±54,8*
4-я	1090,4±25,9,

Примечание: * – различия по сравнению с 4-й группой; ** – различия по сравнению с 2-й группой; *** – различия по сравнению с 3-й группой, p<0,05.

Следовательно, введение мезенхимальных стволовых клеток позволяет обеспечить развитие полноценной соединительной ткани в зоне глубокого термического ожога в более ранние сроки.

Заключение. Использование адипогенных мезенхимальных стволовых клеток без некрэктомии позволяет достичь заживления ран к 34 суткам, то есть ускорить процессы регенерации на 24%, а также сократить площадь рубца на 69% по сравнению с контрольной группой животных. На фоне введения стволовых клеток в биоптатах отмечается более раннее развитие зрелой соединительной ткани, толщина новобразованных грануляций на 47% больше, чем в 4-й группе. Применение раневых покрытий на основе алифатического сополиамида и хитозана в зоне глубоких термических ожогов после их некрэктомии позволяет достичь полного заживления раны к 24 суткам, ускоряя процессы регенерации на 47%, площадь рубца при этом уменьшается на 375%. Использование в этих же условиях раневых покрытий на основе гидрогеля гиалуроновой кислоты позволяет сократить сроки заживления на 16% и сократить площадь рубца на 52%.
В целом использование стволовых клеток в лечении глубоких термических ожогов кожи III степени представляется перспективным способом их лечения. Местное введение адипогенных мезенхимальных стволовых клеток в зону дефекта кожи позволяет реализовать паракринный эффект [7-8], который стиму-лирует миграцию собственных, в том числе стволовых клеток в область повреждения.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 14-33-00003.