Децеллюляризированный матрикс тонкой кишки. Технология получения, оценки и направления использования
- Авторы: Кокорина А.А.1, Кромский С.В.2, Кривенцов А.В.1, Михайлова Е.В.2, Пак Н.В.1, Кондратенко А.А.1, Сигарева Л.П.2, Сидорин В.С.1, Костина О.В.1, Онищенко Л.С.1, Александров В.Н.1,2
-
Учреждения:
- Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
- Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
- Выпуск: Том 22, № 4 (2020)
- Страницы: 87-90
- Раздел: Экспериментальные исследования
- Статья получена: 06.03.2021
- Статья опубликована: 15.12.2020
- URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/62811
- DOI: https://doi.org/10.17816/brmma62811
- ID: 62811
Цитировать
Полный текст
![Открытый доступ](https://journals.eco-vector.com/lib/pkp/templates/images/icons/text_open.png)
![Доступ закрыт](https://journals.eco-vector.com/lib/pkp/templates/images/icons/text_unlock.png)
![Доступ закрыт](https://journals.eco-vector.com/lib/pkp/templates/images/icons/text_lock.png)
Аннотация
Матрикс (скаффолд, матрица, каркас, шаблон) – биорезорбируемый или небиорезорбируемый материал, который in/ex vivo может быть заполнен стволовыми или соматическими клетками с целью получения тканеинженерной конструкции для восстановления утраченного органа, части органа, ткани. Естественно, что для достижения конструкцией морфофункциональных свойств копируемого органа, части органа, ткани матрикс ее должен быть в необходимой степени прочным, неиммуногенным, биоактивным. Для того чтобы ткань могла прорастать в трех измерениях, матрица должна быть пористой. Причем пористость матрикса должна быть открытой, а диаметр пор должен превышать диаметр клеток, составляя около 100 мкм, то есть иметь размер, достаточный для миграции клеток по всему матриксу, их питания и ангиогенеза, а также выведения продуктов метаболизма. Более того, поверхность матрицы должна быть шероховатой, и, что особо важно, матрикс должен содержать эндо- или экзогенного происхождения факторы хемотаксиса, адгезии клеток, их пролиферации, дифференцировки. В этом контексте на примере создания персонифицированного децеллюляризированного матрикса тонкой кишки освещается ряд принципиальных вопросов. Прежде всего это вопросы, касающиеся выбора материала матрикса, технологии его получения, оценки матрикса в соответствии с критериями, отвечающими матрице для тканевой инженерии, и возможных направлений его использования. В конечном итоге методом детергентно-ферментной перфузионной децеллюляризации удалось получить персонифицированный неиммуногенный внеклеточный матрикс тонкой кишки, достаточный по своим характеристикам для использования в разных направлениях приложения тканевой инженерии, включая пластику дефектов кожных покровов, слизистых оболочек, тонкой кишки и пр.
Ключевые слова
Полный текст
Введение. На пороге нынешнего века развивающиеся биология и медицина выдвинули задачи, нацеленные на поиск материалов, способных заменить органы и ткани человека. Решение подобных задач сопряжено с глубоким пониманием основных положений медицины, цитологии, биофизики, химии, на стыке которых возникло такое направление современных клеточных технологий, как тканевая инженерия, ключевой задачей которой является разработка тканеинженерных конструкций – прообразов органов и тканей человека. Тканеинженерная конструкция включает матрицу-носитель, а также стволовые или соматические клетки. Получить матрицу можно методом децеллюляризации, то есть удалением клеток из исходной нативной ткани/органа, что делает ее неиммуногенной, а при использовании оптимального протокола децеллюляризации и идентичной по своим морфофункциональным свойствам матрице копируемого органа [3]. Методом децеллюляризации авторами ранее были получены каркасы кровеносного сосуда и трахеи [1].
Цель исследования. Разработать протокол получения децеллюляризированного матрикса (ДЦМ) тонкой кишки, отвечающего свойствам матрицы для тканевой инженерии.
Материалы и методы. В работе использовали 12 крыс-самцов линии Вистар с массой тела 200–300 г из питомника «Рапполово» (Санкт-Петербург). Крыс содержали в отдельных клетках со свободным доступом к воде, корму и при стандартном суточном режиме освещения. Работу с лабораторными животными осуществляли в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23.08.2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» [2].
Животных-доноров тонкой кишки (ТК) усыпляли летальной дозой эфира через 30 мин после интраперитонеальной инъекции гепарина (1250 МЕ). Выполняли тотальную срединную лапаротомию, ТК извлекали из брюшной полости и укрывали марлевой салфеткой, пропитанной физиологическим раствором. Верхнюю брыжеечную артерию (arteria mesenterica cranialis крысы – аналог arteria mesenterica superior человека) мобилизировали, в просвет ее вводили канюлю 26G, фиксировали шовным материалом (рис. 1).
Рис. 1. Канюлирование a. mesenterica cranialis
Тонкую кишку с брыжейкой извлекали, в просвет ее вводили обрезанную пипетку Пастера, которую фиксировали шовным материалом. Через нее физиологическим раствором с гентамицином (50 мкг/мл) из кишки вымывали содержимое.
К перистальтическому насосу «Minipuls 3» фирмы «Gilson» (Соединенные Штаты Америки – США) силиконовыми трубками подключали пипетку Пастера для промывания просвета кишки со скоростью 60 мл/мин. Шприцевый дозатор «МР-2003» фирмы «Армед» (Россия) и канюлю, введенную в верхнюю брыжеечную артерию, использовали для перфузии со скоростью 1 мл/мин. Протокол децеллюляризации включал последовательную обработку деонизированной водой, 1% Triton X-100 и 1% додецилсульфатом натрия. Обработка гипотоническим раствором, предсуществующая протоколу, обеспечивала заключительную очистку кишки от дебриса и первичное разрушение клеток, а последний этап протокола способствовал отмывке матрикса от децеллюляризирующих агентов (табл. 1).
Таблица 1
Протокол децеллюляризации тонкой кишки крысы
Реагент | Длительность обработки, ч |
Деионизированная вода | 4 |
1% Triton X-100 | 15 |
Деионизированная вода | 1 |
1% додецилсульфат натрия | 8 |
Фосфорно-солевой буфер | 16 |
Стерильность полученного матрикса оценивали визуально. В стерильную питательную Дульбекко модифицированную среду Игла (ДМЕМ), содержащую феноловый красный, фирмы «Биолот» (Россия) помещали фрагмент каркаса массой до 0,1 г, который инкубировали 7 суток при 37°С. В качестве отрицательного контроля использовали аналогичные пробирки с добавлением 1 мл стерильного физиологического раствора.
После децеллюляризации проводили гистологическое исследование разных участков матрикса (проксимального, дистального и срединного). Фрагменты помещали в 10% нормальный забуференный формалин и после стандартной гистологической проводки изготавливали парафиновые срезы толщиной 4–5 мкм для окрашивания гематоксилином и эозином, а также 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлоридом (DAPI) – тропным к нуклеиновым кислотам флуоресцентным красителем. Сравнение проводили с гистологическими препаратами нативной ТК крысы.
Количественное определение нуклеиновых кислот (НК) проводили по стандартной методике в нативной ТК крысы и в полученном ДЦМ. НК выделяли из сухого материала известной массы с использованием коммерческого набора «Genomic DNA Purrification Kit» фирмы «Thermo scientific» (США). Оптическую плотность измеряли с использованием спектрофотометра «Epoch2» фирмы «BioTek» (США) при длинах волн 260 и 280 нм, результат вычисляли как частное этих значений.
Сохранность микроархитектоники каркаса исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа «H-600» фирмы «Hitachi» (Япония). Материал фиксировали по стандартной методике. Полутонкие срезы (1–2 мкм) и ультратонкие срезы (30–70 нм) получали на ультратоме «Reichert-Jung» фирмы «Heidelberg» (Германия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца.
Оценку цитотоксичности матрикса проводили на дермальных фибробластах человека с использованием МТТ-теста (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид). Клетки культивировали в ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки фирмы «HyClone» (Новая Зеландия) и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина фирмы «Gibco» (США) в монослое при 37°С и 5% СО2, меняя среду каждые трое суток. Лунки 96-луночного планшета заполняли кусочками ДЦМ площадью примерно 0,75 мм2. Затем в лунки вносили 4×103 фибробластов, в качестве контроля использовали лунки, содержащие ДЦМ, но не клетки. Через двое суток проводили МТТ-тест: к ДМЕМ добавляли МТТ до концентрации 0,5 мг/мл, инкубировали 4 ч. Затем среду убирали, а формазан растворяли в диметилсульфоксиде, перемешивали на шейкере и оценивали оптическую плотность при длине волны 570 нм.
Оценку механической прочности ДЦМ проводили методом растяжения на испытательной машине «AGS-X» фирмы «Shumadzu» (Япония). Вычисляли максимальную нагрузку, при которой происходит разрыв ДЦМ в сравнении с интактной тканью ТК крысы.
Результаты и их обсуждение. Выбор агентов для децеллюляризации, а также использование перфузионного метода с одновременной перфузией сосудистой системы ТК и ее просвета позволили получить стерильный прозрачный цельный матрикс ТК с сохранной сосудистой системой (рис. 2).
Рис. 2. Внешний вид тонкой кишки на разных этапах эксперимента: а – нативная ТК крысы, б – ДЦМ, в – окрашивание сосудистой сети трипановым синим
Использование комбинации неионного и ионного детергентов, гипотонической жидкости, подбор оптимальной скорости подачи рабочих растворов способствовали сохранности микроархитектоники ТК, но не клеточного материала. Действительно, если слизистая нативной тонкой кишки имеет типичное для нее строение: бархатистый вид от покрывающих ее многочисленных кишечных ворсинок – отростков слизистой, покрытых цилиндрическим эпителием, то гистология децеллюляризированной кишки отличается от таковой нативной кишки только отсутствием клеточного материала и внутриклеточных структур, в частности НК (рис. 3).
Рис. 3. Морфология ДЦМ и нативной ТК, ув. ×100
Электронные фотографии ДЦМ дают также возможность отметить его полную сохранность – отсутствие явных повреждений – деформаций, разрывов и, кроме того, каких-либо остатков внутриклеточных структур, включая ДНК (рис. 4).
Рис. 4. Сохранность кишечных ворсинок в децеллюляризированном матриксе тонкой кишки, масштабный отрезок – 500 мкм
НК считаются основными компонентами децеллюляризированной ткани, способными вызвать иммунную реакцию с риском отторжения трансплантата. Содержание ее в продуктах подобного рода должно быть менее 50 нг/мг сухой массы или менее 30% от исходного количества [4]. Нативная ТК крысы, согласно нашим данным, содержала 215±58 нг/мг НК. Этот показатель для бесклеточного матрикса составил 13,8±0,5 нг/мг, демонстрируя тем самым, что протокол позволяет элиминировать почти 94% НК (рис. 5).
Рис. 5. Количество ДНК в интактной ТК крысы и в ДЦМ
Наконец, принципиальными являются еще два обстоятельства. Во-первых, протокол децеллюляризации ТК, представленный нами, не влияет на биосовместимость матрикса. Фибробласты человека, на нем культивируемые, через двое суток сохраняли свою жизнеспособность и пролиферировали (рис. 6).
Рис. 6. Сравнение количества жизнеспособных фибробластов, посеянных на ДЦМ и на специализированный адгезивный пластик
Количество жизнеспособных дермальных фибробластов человека на ДЦМ и специализированном адгезивном пластике статистически не различалось, хотя и замечена тенденция к более быстрому росту клеток на пластике.
Во-вторых, протокол децеллюляризации тонкой кишки, как отмечено выше, не повреждает матрикс и не влияет на его прочность на растяжение. Разрыв образца ткани нативной ТК при растяжении происходил при нагрузке 0,93±0,06 Н, ДЦМ – 0,77±0,13 Н, что свидетельствует о сохранности механических свойств ДЦМ (рис. 7).
Рис. 7. Прочность на растяжение ДЦМ и нативной ТК
Заключение. В соответствии с разработанным оригинальным протоколом перфузионной децеллюляризации ТК получена матрица со свойствами, необходимыми и достаточными для тканевой инженерии дефектов кожных покровов, слизистых оболочек и ряда трубчатых, а возможно, и солидных органов.
Собственно, разработанный протокол получения ДЦМ ТК несет в себе потенциальную возможность получения неиммуногенных матриксов иных органов, части органов и тканей для тканевой инженерии.
Об авторах
А. А. Кокорина
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Автор, ответственный за переписку.
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
С. В. Кромский
Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. В. Кривенцов
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
Е. В. Михайлова
Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
Н. В. Пак
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
А. А. Кондратенко
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
Л. П. Сигарева
Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
В. С. Сидорин
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
О. В. Костина
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
Л. С. Онищенко
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
В. Н. Александров
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова; Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
Email: vmeda-nio@mil.ru
Россия, Санкт-Петербург
Список литературы
- Александров, В.Н. Тканевая инженерия трубчатых органов / В.Н. Александров [и др.] // Сборник статей II Всероссийской научно-технической конференции «Состояние и перспективы развития современной науки по направлению «Биотехнические системы и технологии». – Анапа, 2020. – С. 171–179.
- Добровольская, И.П. Полимерные матрицы для тканевой инженерии / И.П. Добровольская [и др.] – СПб.: Издательско-полиграфическая ассоциация университетов России, 2016. – 224 с.
- Миней, Е.Дж. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей / Е.Дж. Миней [и др.] // Техносфера. – М., 2007. – С. 22–33.
- Сотниченко, А.С. К вопросу о морфологических критериях децеллюляризации органов и тканей / А.С. Сотниченко [и др.] // Вестн. трансплантологии и искусственных органов. – 2017. – № 19 (3). – С. 65–69.
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)