Генетические полиморфизмы каталазы (rs7943316), глутатионпероксидазы-1 (rs1050450) и трансферрина (rs8177178) при кератоконусе на примере ограниченной группы пациентов российской популяции

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Кератоконус (КК) — генетически детерминированное заболевание, связанное с дистрофией роговицы глаза, ее истончением, растяжением с последующим конусовидным выпячиванием, помутнением и рубцеванием, что приводит к значительному снижению остроты зрения и нередко инвалидизации. Количество больных колеблется от 4 до 600 случаев на 100 тыс. населения в зависимости от географического региона [1, 2]. Лечение КК продолжительное и сложное. С этой целью применяются высокотехнологичные хирургические методики (кросслинкинг, имплантация стромальных колец, кератопластика в различных модификациях), которые предупреждают дальнейшее прогрессирование клинических признаков, не устраняя причину заболевания [3, 4]. При этом прогноз последующего развития симптоматики нередко остается неопределенным [5, 6].

Одним из ведущих механизмов патогенеза при КК считается оксидативный стресс. Этот процесс может развиваться в структурах роговой оболочки глаза как результат наследственно обусловленной несостоятельности ферментов, обеспечивающих антиоксидантную защиту, а также регулирующих другие механизмы естественной детоксикации. Среди генетических факторов, ассоциированных с развитием КК, исследованы однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) таких генов, как каталаза (CAT), глутатионпероксидаза-1 (GPX-1), трансферрин (TF) [7].

Каталаза является распространенным ферментом, который содержится в клеточных пероксисомах. Этот фермент представляет собой тетрамер с молекулярной массой около 240 кДа с четырьмя группами гема на тетрамер [8, 9]. Дефицит каталазы может вызвать повышенные концентрации перекиси водорода и увеличить риск развития окислительного стресса [10]. Ген CAT расположен в локусе хромосомы 11p13 и включает 13 экзонов. Наиболее изучен полиморфизм rs7943316 (A/T), локализованный в области промотора [11].

Глутатионпероксидаза-1 — селенсодержащий фермент, который является внутриклеточным антиоксидантом и защищает организм от окислительного повреждения. Ген GPX-1, расположен в хромосоме 3p21.3 [12, 13]. Среди SNP-мутаций этого гена, наибольшее клинически подтвержденное значение имеет полиморфизм rs1050450 (C > T), который изменяет аминокислоту пролин (PRO) на лейцин (LEU) в положении 197. Мутантный аллель этого гена ассоциируется со сниженной способностью поглощать активные формы кислорода (АФК).

Трансферрин относится к ферментам антиоксидантной защиты и представляет собой гликозилированый белок, обеспечивающий гомеостаз железа в клетках. Выводя ионы железа за пределы клеточной оболочки, TF контролирует их вовлечение в индукцию окислительного стресса. Ген TF находится в участке третьей хромосомы 3q21. Множественные мутации гена TF определяют выраженную этническую полиморфность кодируемого им белка [14]. С развитием КК в европейской популяции наиболее ассоциирован полиморфизм rs8177178 (G > A).

Насколько нам известно, комплексные исследования роли полиморфизмов генов антиоксидантной защиты у российских пациентов, страдающих КК, до настоящего времени не проводились. В связи с этим настоящее исследование было направлено на оценку влияния полиморфизмов CAT rs7943316 A/T, GPX-1 rs1050450 C/T и TF rs8177178 (G>A) у пациентов, страдающих КК, в выборке населения европейской части России. Эти полиморфизмы могут изменять антиоксидантную способность энзимов, приводя к синергическим эффектам с КК, вызванным окислительным повреждением.

В популяции населения центрального азиатского региона генотип АА и аллель А rs7943316 A/T в гене CAT значительно снижают риск развития КК. Кроме того, GPX-1 rs1050450 C/T аллель T связан с повышенным риском КК. Генетические вариации в антиоксидантной защите могут снижать антиоксидантную способность или усиливать окислительный стресс и изменять риск развития КК у пациентов. SNP и варианты генов предполагают сложную этиологию или конвергенцию нескольких путей заболевания. Повышение окислительного стресса от SNPs в специфических антиоксидантных ферментах, возможно, связано с заболеванием [15].

Цель исследования — изучение ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов в генах CAT (rs7943316), GPX-1 (rs1050450) и TF (rs8177178) с риском КК в выборке российской популяции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обследованы 25 пациентов с диагностированным КК (23 мужчины и 2 женщины в возрасте от 21 до 49 лет, средний возраст 27,76 ± 1,75 лет), проходивших лечение в клинике офтальмологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова в 2019 и 2020 гг. В контрольную группу были включены 20 здоровых лиц, не страдающих этой патологией (6 мужчин и 14 женщин в возрасте от 23 до 40 лет, средний возраст 24,9 ± 0,6 лет). Все обследованные представляли выборку населения европейской части России. Исследования проводились в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice — GCP) и принципами Хельсинкской декларации [16, 17]. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. До включения в исследование у всех участников было получено письменное информированное согласие. Диагностика КК осуществлялась на основании данных объективного обследования в соответствии с общепринятыми критериями [18].

Толщина роговицы определялась путем кератотопографии с использованием прибора «Pentacam» фирмы «Oculus» (Соединенные Штаты Америки — США). Результаты измерения оценивались в проекции центра зрачка.

Материалом исследования служила венозная кровь в пробирках с этилендиаминтетрауксусной кислотой. В работе использовали пробы крови, взятой у пациентов в момент их поступления на стационарное лечение. Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) из проб крови выделяли стандартным фенол-хлороформным способом с использованием протеиназы К. Клеточный детрит, содержащий ДНК, получали путем центрифугирования 2 мл венозной крови (5000 об/мин, 15 мин). Надосадочную жидкость сливали и добавляли 1 мл буфера N — [трис (гидроксиметил) метил] -2-аминоэтансульфоновой кислоты (TES-буфер), перемешивали и вновь центрифугировали. Эту процедуру повторяли дважды. Полученный материал разводили в 1 мл TES-буфера и добавляли по 10 мкл протеиназы-К (20 мг/мл), после ресуспендирования в каждую пробу добавляли по 25 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS), до концентрации в растворе 0,5%. После инкубирования при температуре 58 ℃ в течение 2 ч в образцы вносили по 0,5 мл фенола (pH = 8), перемешивали на ротаторе в течение 10 мин, центрифугировали (10 тыс. об/мин — 10 мин). Супернатант отбирали в пробирки, в каждую из которых добавляли по 30 мкл NaCl и по 1 мл 96% этилового спирта, интенсивно перемешивали. После центрифугирования (10 тыс. об/мин — 5 мин) использовали осадок, добавляя к нему по 1 мл 70% этилового спирта. Вновь перемешивали и центрифугировали (10 тыс. об/мин — 5 мин). Для полного испарения спирта открытые пробирки с пробами инкубировали в течение 20 мин. Содержащий выделенную ДНК осадок, разводили ТЕ буфером (по 50–300 мкл буфера в соответствии с количеством выделенной ДНК) и растворяли на ротаторе в течение 24 ч. Качественную и количественную оценку выделенной ДНК проводили с помощью спектрофотометра «NanoDrop 2000» фирмы «Thermo Fisher Scientific» (США) и в дальнейшем хранили при температуре –20 °C.

Генотипирование проводилось путем анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. При проведении амплификации реакционная смесь для полимеразной цепной реакции включала следующие реактивы: деионизированная вода — 6 мкл.; 5-кратный Taq Red-буфер научно-производственной организации (НПО) «Евроген» (Россия) — 2 мкл; dNTPs НПО «Евроген» (Россия) — 1,2 мкл 2,5 мМ; прямой и обратный праймеры — по 0,1 мкл 20 мкМ (табл. 1); Taq-ДНК-полимераза НПО «СибЭнзим» (Россия) — 0,2 мкл, 1 U, матрица выделенной ДНК — 0,4 мкл. В работе использовали амплификатор «С1000» фирмы «BioRad» (США). Амплификацию проводили при следующих режимах: начальная денатурация — 95 °С, 5 мин; основная денатурация — 95 °С, 20 с; отжиг праймеров — Tm °С, 20 c; элонгация — 72 °С, 20 c; финальная элонгация — 72 °С, 5 мин. Этапы со 2-го по 4-й повторялись циклически 35 раз.

 

Таблица 1. Характеристика использованных праймеров

Table 1. Characteristics of the primers used

Ген/полиморфизм	Праймер (прямой/обратный)	Tm* (°C)/продукт амплификации, п. н.
CAT rs7943316 — A/T	5-CTTCCAATCTTGGCCTGCCTAG-3 5-CCGCTTTCTAAACGGACCTTCG-3	95/312
GPX-1 rs1050450 — C/T	5-TTATGACCGACCCCAAGCTC-3 5-GACACCCGGCACTTTATTAGTG-3	95/349
TF-2 rs8177179 — A > G	5-AGCTGTATGTGTGCATGCTGCTC-3 5- GGGCCAATTCACACATTCAAT-3	60,5/472

Примечание: * — Tm — температура отжига праймеров; п. н. — пар нуклеотидов.

 

 

Выявление SNP мутаций в полученном после амплификации материале проводили с использованием эндонуклеаз рестрикции, подобранных к нуклеотидным последовательностям точек мутации. В пробы добавляли по 2–5 ед. активности фермента и инкубировали. Образованные в результате рестрикции фрагменты разделяли посредством электрофореза на 2% агарозном геле с использованием электрофоретической камеры «Sub-Cell GT» фирмы «BioRad» (США). В работе использовали агарозу LE фирмы «Thermofisher» (США), разведенную на TBS-буфере с добавлением этидия бромида (biotechnology Grade). Размер рестрикционных фрагментов ДНК оценивали с помощью стандартных маркеров длин ДНК (100 bp и 50+ bp DNA Ladder). Учет результатов электрофореза осуществляли с помощью трансиллюминатора «ECX-20M» фирмы «Vilber Lourmat» (Франция). Результаты фиксировали с помощью системы гель-документации (рис.).

 

Рис. Схемы электрофореза для обнаружения SNP и идентификации генотипов в генах CAT, GPX-1 и TF: a — CAT rs7943316, бенды фрагментов рестрикции 109, 203, 312 bp соответствуют гетерозиготному генотипу, фрагменты 203, 312 bp — гомозиготный генотип АА, фрагмент 312 bp — генотип ТТ; b — GPX-1 rs1050450, CT — гетерозигота (84/88, 218, 306bp), CC — гомозигота (84/88, 218bp); c — TF rs7943316, AG — гетерозигота (472/274/198 bp), AA — гомозигота (274/198 bp), GG — гомозигота (472 bp); М — маркер ДНК (100 bp)

 

На основании полученных данных (количество и величина рестрикционных фрагментов) определяли генотип обследованных пациентов (табл. 2).

 

Таблица 2. Условия проведения рестрикционного анализа и интерпретация результатов

Table 2. Restriction analysis conditions and interpretation of results

Ген/полиморфизм	Эндонуклеаза и условия инкубации, °С/ч	Генотип: рестрикционные фрагменты, п. н.
CAT rs7943316 — A/T	Hinf I 37/3	АА: 203, 312; АТ: 109, 203, 312; ТТ: 312
GPX-1 rs1050450 — C/T	Apa I 37/3	CС: 84, 88, 218; СТ: 84, 88, 218, 306; ТТ: 84, 306
TF-2 rs8177179 — A > G	BssТ1 I 60/3	AA: 274, 198; AG: 472, 274, 198; GG: 472

 

Сравнение количественных вариантов между группами оценивалось с помощью t-критерия Стьюдента. Частоты аллелей и генотипов анализировались с использованием хи-квадрата и точного теста Фишера. Также оценивались отношения шансов (odds ratio — OR) и 95% доверительные интервалы (ДИ), р < 0,05 считалось статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Средние значения толщины роговицы у больных КК были достоверно ниже, чем у здоровых лиц и составляли 470,5 ± 4,9 мкм и 533,7 ± 3,6 мкм соответственно (p < 0,05).

Частотные распределения CAT rs7943316 генотипов A/T у пациентов, страдающих КК, имели следующие значения: ТТ — 40%, TA — 52% и AA — 8%; среди здоровых: TT — 35%, TA — 55%, и АА — 2,7%. Нам не удалось выявить существенной связи этого SNP с развитием КК. Ни один из аллелей (А и Т) не имел существенного значения в снижении риска развития КК (OR = 0,78; 95% ДИ = 0,33–1,88 p = 0,59) (табл. 3).

 

Таблица 3. Генотипы и аллельное распределение в генах CAT, GPX-1 и TF среди больных кератоконусом и здоровых

Table 3. Genotypes and alleles of the CAT, GPX-1, and TF genes among patients with keratoconus and healthy individuals

Вариант	Пациенты, n (%)	Контрольная группа, n (%)	OR (95% ДИ)	p*	Сила связи **
rs7943316, CAT
TT	10 (40)	7 (35)	1,78 (0,36–4,18)	0,73	несущественная
TA	13 (52)	11 (55)	0,88 (0,27–2,88)	0,84	несущественная
AA	2 (8)	2 (10)	0,78 (0,10–6,10)	0,86	несущественная
Аллель T	34 (68)	25 (62,5)	0,78 (0,33–1,88)	0,59	несущественная
Аллель A	16 (32)	15 (37,5)
rs1050450, GPX-1
CC	14 (56)	6 (30)	2,97 (0,86–10,3)	0,47	несущественная
CT	11 (44)	14 (70)
TT	0 (0)	0 (0)	–	–	–
Аллель C	39 (78)	26 (65)	1,91 (0,75–4,85)	0,17	слабая
Аллель T	11 (22)	14 (35)
rs8177179, TF
АА	5 (20)	8 (40)	0,34 (0,09–1,31)	0,11	средняя
AG	10 (40)	2 (10)	5,67 (1,07–30,0)	0,12	средняя
GG	10 (40)	10 (50)	0,74 (0,22–2,47)	0,62	несущественная
Аллель A	20	24	0,44 (0,19–1,04)	0,06	слабая
Аллель G	30	16

Примечание: * — уровень значимости χ²; ** — на основе φ-критерия.

 

Распределения частот генотипов CC и CT полиморфизма гена GPX-1 rs1050450 C/T у пациентов, страдающих КК, составили: 56 и 44%, а у здоровых лиц — 30 и 70% соответственно. Аллель Т был слабо связан с КК и незначительно увеличивал риск КК по сравнению с аллелем C, однако достоверность этих показателей была недостаточной, чтобы расценивать их как значимые (OR = 1,91; 95% ДИ = 0,75–4,85; p = 0,17).

Генотипы и аллели гена TF rs8177179 у пациентов, страдающих КК, имели следующее распределение: AA — 20%, AG — 40%, GG — 40%; а в контрольной группе — 40, 10 и 50% соответственно. Присутствие в генотипе аллеля А увеличивало частоту встречаемости КК, при этом аллель G уменьшал его. Наблюдалось увеличение частоты встречаемости КК, связанное с генотипом AG полиморфизма rs8177179 (OR = 5,67, 95% ДИ = 1,07 — 30,00; p = 0,12. Корреляционной связи между генотипом GG и встречаемостью КК не обнаружено (OR = 0,74; 95% ДИ = 0,22–2,47; p = 0,62).

В целом анализ полученных нами результатов не позволил выявить связь с КК ни одного из генотипов и аллелей CAT rs7943316 A/T. Анализ распределения частот генотипов гена GPX-1 rs1050450 C/T показал слабую связь аллеля Т с КК, его присутствие в генотипе повышало относительный риск возникновения клинических признаков заболевания. Отсутствие значимой связи КК с мутациями в генах антиоксидантных ферментов CAT и GPX-1 может объясняться тем, что ультрафиолетовое излучение, являясь причиной появления активных форм кислорода, как этиологический фактор в патогенезе КК играет незначительную роль в условиях европейской части России. Однако малое количество наблюдений не дает оснований делать однозначные утверждения.

Известно, что антиоксидантнтная защита структурных элементов роговицы может обеспечиваться за счет трансферрина. Вариации в гене TF могут способствовать повышению уровня несвязанного железа, что приводит к окислительным повреждениям и развитию КК [19]. В некоторых европейских популяциях, в частности в выборке популяции Центральной и Восточной Польши генотип A/A и аллель A полиморфизма g.3296G > A гена TF связаны с увеличением частоты встречаемости КК [20]. Нами выявлена слабая и умеренная корреляционная связь TF rs8177179 c развитием КК среди обследованных пациентов. Наблюдалось незначительное увеличение частоты встречаемости КК у гетерозиготных пациентов (генотип AG). Риск клинических проявлений заболевания имел слабую тенденцию к росту в присутствии аллеля А полиморфизма rs8177179, однако с отсутствием статистической значимости.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, полученные нами, содержат предварительные данные изучения связи между развитием КК и полиморфизмами генов ферментов антиоксидантной защиты в российской популяции. При этом они имеют некоторые ограничения. Например, рассмотрен только один полиморфизм каждого гена, связанного с КК, и не исследованы разные этнические группы.

В целом полученные нами данные позволяют предположить, что этиологические факторы в патогенезе КК для российской популяции могут иметь больше сходства с европейским населением, чем с популяцией центрального азиатского региона. Для подтверждения этого предположения необходимы дальнейшие исследования с участием представителей различных этнических групп и национальностей. Целесообразно более подробное изучение полиморфизмов гена TF (в частности rs8177178), способных модулировать риск КК за счет изменения гомеостаза железа и индукции окислительного стресса.

Об авторах

Алексей Иванович Соловьев

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: solopiter@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3731-1756
SPIN-код: 2502-8831

доктор медицинских наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Сергей Викторович Чурашов

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Автор, ответственный за переписку.
Email: Churashoff@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1197-9237

доктор медицинских наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Алексей Николаевич Куликов

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: alexey.kulikov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5274-6993

доктор медицинских наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Адриан Викторович Булеев

Лаборатория молекулярной генетики Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных

Email: adlerpro2008@gmail.com

аспирант

Россия, Санкт-Петербург

Анна Алексеевна Крутикова

Лаборатория молекулярной генетики Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных

Email: anntim2575@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2561-145X

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Артем Русланович Арюков

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: arukov.artem@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8774-5467

аспирант

Россия, Санкт-Петербург

Вячеслав Юрьевич Кравцов

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: kvyspb@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-3910-5160

доктор биологических наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы