Определение состава и токсичности поражающих элементов при огнестрельных и минно-взрывных ранениях позвоночника

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Огнестрельные ранения позвоночника и спинного мозга как вид боевых повреждений остаются одной из наиболее трагических разновидностей ранений, сопровождающихся высокой летальностью во всех периодах травматической болезни спинного мозга и выраженной стойкой инвалидизацией большинства пострадавших [1]. В то же время огнестрельные ранения позвоночника и спинного мозга являются относительно редким видом боевой патологии. В период Великой Отечественной войны их частота зависела от вида боевых действий войск и составляла 0,5–3 % [2]. По данным локальных войн, в частности при ведении боевых действий в Республике Афганистан и Чеченской Республике, частота огнестрельных ранений позвоночника и спинного мозга составила 4,7–5,1 % [3]. Как показывает опыт высокотехнологичных локальных вооруженных конфликтов настоящего времени, в подавляющем большинстве случаев ранения являются минно-взрывными, осколочными, носят сочетанный и комбинированный характер, что обусловливает тяжесть состояния раненых. В последние годы хирурги придерживаются активной тактики лечения, указывая на ее высокую эффективность. Также лечение должно быть комплексным, особенно при сочетанном характере ранений [4, 5].

Огнестрельные ранения настоящего времени отличаются от ран прошлых войн еще большим разнообразием и тяжестью обширности зоны поражения тканей по периферии от раневого канала [6–8]. В локальных войнах боевые действия ведутся с применением современных видов оружия, и в каждом из регионов они обладают своей спецификой. Металлические осколки авиабомб, артиллерийских снарядов, ракет, гранат или наземных мин определяются как шрапнель.

В настоящее время при локальных военных конфликтах в период боевых действий активно используется артиллерия и различные виды ударных беспилотных летательных аппаратов, которые работают как взрывные устройства, есть примеры применения снарядов с обедненным ураном. Озабоченность по поводу воздействия обедненного урана на здоровье людей и окружающую среду побудила многие страны искать альтернативы ему в бронепробиваемых боеприпасах, и в качестве заменителей были предложены материалы на основе вольфрама. Однако после имплантации в мышцы конечностей лабораторных грызунов гранул из композита военного назначения (вольфрам/никель/кобальт) в них развивались высокоагрессивные злокачественные рабдомиосаркомы [9]. Кроме того, даже вдыхание частиц пыли пустыни во время войны в Персидском заливе приводило к вспышкам респираторных заболеваний неизвестной этиологии, называемых «тяжелым острым пневмонитом». Более тщательное исследование пыли иракской пустыни показало, что эти частицы имели глинистую или кварцевую сердцевину, окруженную неорганическим слоем карбоната кальция, содержащего различные металлы, в том числе (в порядке уменьшения концентрации) алюминий, железо, уран, никель, кобальт, медь, свинец, хром [10].

Свинец, обычно содержащийся в пулях, представляет собой химический элемент, классифицируемый как тяжелый металл, который может вызывать повреждения посредством ионной мимикрии, нарушения внутриклеточного гомеостаза кальция, ингибирования синтеза оксида азота, производства окислительного стресса и изменения транскрипции генов, включая образование подострых и отсроченных абсцессов [11].

Цель исследования — оценить целесообразность извлечения металлических осколков, полученных при огнестрельных и минно-взрывных ранениях позвоночника, на основании результатов исследования их состава и цитотоксичности по отношению к мезенхимным стромальным клеткам (МСК).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом исследования служили поражающие элементы, удаленные из позвоночника и паравертебральных тканей. Показаниями к удалению металлических осколков при ранениях позвоночника и спинного мозга стали слепые проникающие ранения позвоночника и спинного мозга, корешков конского хвоста, а также слепые непроникающие и паравертебральные ранения позвоночника. Доступные металлические осколки удалялись с применением малоинвазивных технологий (тубусных ретракторов и эндоскопически; рис. 1).

 

Рис. 1. Минимально инвазивное удаление осколка из паравертебральных мягких тканей: а, b, c, d — этапы выполнения доступа с применением тубулярных ретракторов и установки рабочего тубуса (диаметр 21 мм); e — коррекция положения тубуса под контролем рентгенографии; f — внешний вид удаленного ранящего снаряда

Fig. 1. Minimally invasive removal of a fragment from paravertebral soft tissues; а, b, c, d — stages of preparing access using tubular retractors and installation of a working sheath (21 mm in diameter); e — X-ray guided adjustment of the sheath position; f — removed wounding projectile

 

Для определения состава и цитотоксичности ранящих снарядов были отобраны 4 образца. С целью проведения цитологического исследования первым этапом выполняли подготовку осколков. Металлические осколки поражающих элементов, удаленные из спинного мозга и позвоночника, тщательно отмывали в проточной воде и механически очищали от органических веществ, которые находились на их поверхности. После этого проводили снятие окислов с поверхности осколков с помощью металлической щеточки, затем повторно промывали осколки в проточной воде, высушивали и только после этого отправляли на исследование. Элементный анализ проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) «JSM-7001F» фирмы «Jeol» (Япония). Состав осколков изучен с помощью спектрального анализа, который проводился на базе Физико-технического института им. А.Ф. Иоффе Российской академии наук, Санкт-Петербург.

Для проведения теста на цитотоксичность образцы осколков стерилизовали в 70 % спирте и инкубировали в полной питательной среде (модифицированная среда игла Дульбекко) (Dulbecco’s modified Eagl’s medium — DMEM/F12) фирмы «Gibco» (США), содержащей 1 % незаменимых аминокислот, 10 об. % термически инактивированной фетальной бычьей сыворотки фирмы «HyClone» (США), 1 % L-глутамина, 50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.

Для исследования цитотоксичности использовали клеточную линию человека FetMSCs — мезенхимные стромальные клетки человека (Институт цитологии Российской академии наук, г. Санкт-Петербург). Клетки культивировали в CO2-инкубаторе при 37 °С в увлажненной атмосфере, содержащей воздух и 5 % CO₂ в питательной среде DMEM/F12. Для количественной оценки цитотоксичности оксидов металлов проводили метилтетразолиевый тест (МТТ), содержащий 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (0,1 мг/мл).

Для эксперимента 5×10³ клеток/(100 мкл×лунку) высевали в 96 луночных планшетах и культивировали в течение 24 ч для их прикрепления. Через 1 сут среду сливали и в лунки добавляли полную питательную среду, в которой в течение 3 недель инкубировали осколки. Через 3 сут среду удаляли и вносили 50 мкл/лунку среду DMEM/F12 с МТТ [12]. Клетки инкубировали в CO₂-инкубаторе в течение 2 ч при температуре 37 °С. После удаления надосадочной жидкости образованные метаболически жизнеспособными клетками кристаллы формазана растворяли в диметилсульфоксиде (50 мкл/лунку) и переносили в чистые лунки, а затем определяли жизнеспособность МСК путем измерения их оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны 570 нм. Аналогичные исследования проведены со средой, период инкубирования которой составил 3 мес. Для расчета жизнеспособности МСК использовали анализ полиномиальной регрессии в программе Microsoft Excel (Microsoft Corporation, США).

Статистический анализ проводили путем использования методов статистической обработки, рекомендованных в медицине, фармации и медико-биологических исследованиях, с помощью программы Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, США). Размер выборки предварительно не рассчитывался.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Все исследуемые осколки представляют собой сплавы различных металлов и других химических элементов (рис. 2, табл. 1).

 

Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия поверхности четырех образцов осколков: а — образец 1; b — образец 2; c — образец 3; d — образец 4

Fig. 2. Scanning electron microscopy of the surface of four fragment samples; а — Sample 1; b — Sample 2; c — Sample 3; d — Sample 4

 

Таблица 1. Элементный состав четырех образцов осколков

Table 1. Elemental composition of four fragment samples

Образец 1		Образец 2		Образец 3		Образец 4
Элемент	Массовая доля, %	Элемент	Массовая доля, %	Элемент	Массовая доля, %	Элемент	Массовая доля, %
C	35,2	C	43,69	C	47,77	C	38,49
O	22,25	O	26	O	17,79	O	14,87
F	4,53	Na	2,41	F	1,75	F	4,43
Mg	0,19	Al	0,18	P	0,74	Na	2,01
Al	0,29	Si	0,59	Ca	1,1	P	0,27
Si	1,88	P	0,65	Mn	0,9	Cl	0,21
P	0,19	K	0,3	Fe	23,82	Ca	0,27
S	0,16	Ca	0,76	Cu	3,64	Cr	0,43
K	0,15	Cr	0,36	Zn	2,15	Fe	36,79
Ca	0,69	Fe	24,3	Mo	0,34	Co	0,08
Mn	0,45	Cu	0,37	–	–	Tb	2,15
Fe	27,26	Mo	0,38	–	–	–	–
Cu	4,16	–	–	–	–	–	–
Zn	2,6	–	–	–	–	–	–

 

Разные осколки содержат в своем составе в основном кислород (О₂), в виде оксидов, а также железо (Fе) (образцы 1–4) или медь (Cu) (образцы 1, 3, 4). Во всех образцах также выявлено большое количество углерода (С). Магнитные свойства осколков отличались в зависимости от количества в них различных металлов. Лучшими магнитными свойствами обладали осколки, содержащие большее количество железа.

В процессе инкубирования осколков в полной питательной среде происходит достаточно активное окисление металлов в течение первых нескольких недель, о чем свидетельствует изменение окраски питательной среды и появление оранжевого осадка (рис. 3, а). В процессе дальнейшего инкубирования осколков процесс окисления металлов продолжается достаточно интенсивно, о чем свидетельствует увеличение интенсивности окраски и формирования плотного оранжевого осадка (рис. 3, b).

 

Рис. 3. Внешний вид питательной среды: а — после 3 нед. инкубирования осколков; b — после 3 мес. инкубирования осколков

Fig. 3. External appearance of the nutrient medium; а — after 3-week incubation with fragments; b — after 3-month incubation with fragments

 

Для оценки потенциальной цитотоксичности осколков и оксидов металлов, образующихся в результате инкубирования осколков в питательной среде, к МСК добавляли исследуемую питательную среду и культивировали в течение 3 сут. По истечении указанного времени морфологию клеток оценивали с помощью световой микроскопии (рис. 4).

 

Рис. 4. Световая микроскопия МСК при культивировании в среде после инкубирования с осколками в течение 3 сут: а — образец 1; b — образец 2; c — образец 3; d — образец 4: e — контрольная среда

Fig. 4. Light microscopy of mesenchymal stromal cells cultured in the medium after incubation with fragments for 3 days; а — Sample 1; b — Sample 2; c — Sample 3; d — Sample 4: e — control medium

 

Из рисунка 4 видно, что во всех 4 образцах присутствует осадок оксидов металлов в виде оранжевых отложений. Такой осадок снижает пролиферацию клеток, о чем свидетельствует разница в количестве клеток в экспериментальных образцах по сравнению с контрольным, в котором по истечении 3 сут сформировался монослой клеток. Также наблюдается разница в морфологии клеток, культивируемых в присутствии оксидов металлов и в контрольном образце. В отличие от контрольного образца, где клетки имеют характерную для них вытянутую веретеновидную форму, в экспериментальных образцах клетки имеют более округлую форму. Наибольшее количество распластанных клеток по сравнению с образцами 2–4 наблюдалось в образце 1.

На рисунке 5 представлена диаграмма по оценке жизнеспособности МСК, культивируемых в питательной среде после 3 нед. инкубирования с осколками. Данные МТТ согласуются с результатами световой микроскопии. Количество жизнеспособных клеток в образцах 2–4 существенно уступает количеству клеток в контрольном образце. Количество жизнеспособных клеток в образце 1 больше, чем в образцах 2–4, но тоже уступает контрольному образцу.

 

Рис. 5. МТТ МСК после 3 сут культивирования в присутствии питательной среды после инкубирования с осколками в течение 3 нед.

Fig. 5. Methyl tetrazolium test of mesenchymal stromal cells cultured for 3 days in the medium after incubation with fragments for 3 weeks

 

При более длительном инкубировании осколков в питательной среде (3 мес.) продолжается активное формирование оксидов металлов. Оксиды металла наблюдались в питательной среде вместе с клетками после 3 сут культивирования (рис. 6).

 

Рис. 6. Световая микроскопия МСК при культивировании МСК в среде после инкубирования с осколками в течение 3 сут: а — образец 1; b — образец 2; c — образец 3; d — образец 4; e — контрольная среда

Fig. 6. Light microscopy of mesenchymal stromal cells cultured in the medium after incubation with fragments for 3 days; а — Sample 1; b — Sample 2; c — Sample 3; d — Sample 4; e — control medium

 

Во всех 4 образцах клеток не сформировался клеточный монослой, при этом клетки образцов 1–3 морфологически отличались от клеток контрольного образца. Количество жизнеспособных клеток в такой среде менее 50 % по сравнению с контрольным образцом, о чем свидетельствуют данные МТТ-анализа (рис. 7).

 

Рис. 7. МТТ после 3 сут культивирования в присутствии питательной среды после инкубирования с осколками в течение 3 мес.

Fig. 7. Methyl tetrazolium test after 3-day cultivation in the medium after incubation with fragments for 3 months

 

В целом установлено, что все исследованные осколки состоят из множества химических элементов, сплавов различных металлов. Сравнение элементного анализа и результатов МТТ показало, что все осколки в питательной среде выделяют токсичные окислы металлов, значительно снижающие жизнеспособность окружающих тканей независимо от элементного состава исследованных осколков.

Нежелательных явлений при проведении исследования не отмечено. Ограничением исследования считаем отсутствие сравнительного анализа цитотоксичности ранящих снарядов с биоинертными инородными телами (имплантатами).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного исследования дают основания предположить, что окислы сплавов различных металлов, входящих в состав поражающих элементов, удаленных из позвоночника и паравертебральных тканей, являются токсичными для организма независимо от их элементного состава. Для профилактики осложнений, связанных с возможной местной и/или системной токсичностью металлических осколков, а также ранних и поздних инфекционных осложнений, необходимо стремиться к максимальному удалению ранящих снарядов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Вклад каждого автора. В.П. Орлов — разработка общей концепции; написание статьи; Ю.А. Нащекина — определение токсичности осколков, анализ данных; А.В. Нащекин — оценка состава ранящих снарядов, анализ данных; С.Д. Мирзаметов — удаление осколков, анализ данных; С.М. Идричан — удаление осколков; М.Н. Кравцов — удаление осколков; Д.В. Свистов — дизайн исследования, анализ данных.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

The contribution of each author. V.P. Orlov — development of a general concept; writing an article; Yu.A. Nashchekina — determination of the toxicity of fragments, data analysis; A.V. Nashchekin — assessment of the composition of wounding shells, data analysis; S.D. Mirzametov — removal of fragments, data analysis; S.M. Idrichan — removal of fragments; M.N. Kravtsov — removal of fragments; D.V. Svistov — study design, data analysis.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Об авторах

Владимир Петрович Орлов

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Автор, ответственный за переписку.
Email: vladimir.rlv@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-5009-7117
SPIN-код: 9790-6804

д-р мед. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Юлия Александровна Нащекина

Институт цитологии Российской академии наук

Email: nashchekina.yu@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4371-7445
SPIN-код: 1138-8088

канд. мед. наук

Россия, Санкт-Петербург

Алексей Викторович Нащекин

Физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе

Email: nashchekin@mail.ioffe.ru
ORCID iD: 0000-0002-2542-7364
SPIN-код: 6638-5243
Scopus Author ID: 6603372975
ResearcherId: A-7182-2014

канд. физ.-мат. наук

Россия, Санкт-Петербург

Саидмирзе Джамирзоевич Мирзаметов

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
ORCID iD: 0000-0002-1890-7546
SPIN-код: 5959-1988
Scopus Author ID: 57210236589
ResearcherId: AAE-2675-2022

канд. мед. наук

Россия, Санкт-Петербург

Сергей Михайлович Идричан

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: smidrichan@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-9442-7281
SPIN-код: 1474-1269

канд. мед. наук

Россия, Санкт-Петербург

Максим Николаевич Кравцов

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: neuromax@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2486-6995
SPIN-код: 2742-6397
Scopus Author ID: 57203752367

д-р мед. наук

Россия, Санкт-Петербург

Дмитрий Владимирович Свистов

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: dvsvistov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3922-9887
SPIN-код: 3184-5590
Scopus Author ID: 6602724544

канд. мед. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы