ОЦЕНКА ГЕПАТОТОКСИЧНОСТИ МНОГОКРАТНОГО ВВЕДЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНОГО ПРЕПАРАТА «РИАМИЛОВИР» НА МОДЕЛИ НЕЛИНЕЙНЫХ МОРСКИХ СВИНОК

Полный текст

В настоящее время уделяется много внимания безопасности лекарственных препаратов, и доклинические исследования являются важнейшим этапом в изучении побочных их эффектов. Особенно важно на доклиническом этапе оценить риск развития гепато-токсичности. Лекарственные поражения печени (ЛПП) являются основной причиной острой печеночной недостаточности в США и Европе [2]. Согласно статистике, во Франции ЛПП возникают с частотой 1419 случаев на 100 000 пациентов; по общемировой статистике, ЛПП возникает с частотой 13,9-24 случая на 100 000 пациентов. В доклинических исследованиях у 50 % новых потенциальных лекарственных молекул выявляется гепатотоксичность, которая в клинических исследованиях является самой частой причиной отзыва препаратов [3]. Противовирусный препарат «Риамиловир» используется в клинической практике в составе комплексной терапии гриппа у взрослых и, являясь нуклеотидным аналогом, имеет потенциал для репозиционирования. Данный препарат обладает малой токсичностью при коротком курсе использования [1]. Являясь аналогом пуриновых оснований, этот препарат может быть ингибитором белка теплового шока 90 (heat shock protein 90, HSP90), который играет ключевую роль в жизненном цикле вируса гепатита В и С, вируса герпеса, вируса иммунодефицита человека [4]. Терапия данных вирусных инфекций требует более длительного приема в сравнении с курсом лечения инфекции, вызванной вирусом гриппа. Соответственно риск возникновения нежелательных лекарственных реакций, в том числе ЛПП, может быть значительно выше. Таким образом, оценка потенциального риска гепато-токсичности риамиловира при длительном приеме представляется актуальной целью. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценить гепатотоксическое действие препарата «Риамиловир» при многократном введении на животной модели. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве экспериментальной модели использовались нелинейные морские свинки. До начала эксперимента животные прошли карантин в течение одного месяца. Каждое животное содержалось в индивидуальной клетке в соответствии с ГОСТ Р 53434.2009 от 02.12.2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP)». Таблица 1 Группа Вес животных, г медиана [интерквартильный размах] Дозировка риамиловира, мг/кг/сутки Дозировка риамиловира в перерасчете на ЭДЧ, мг/кг Контрольная группа, 880,0 0 0 n = 5 [520, 0; 967, 0] Группа I, n = 5 832,5 [790, 0; 932, 5] 48 10,2 Группа II, n = 5 861,0 [790, 0; 931, 0] 96 20,4 Группа III, n = 5 916,0 [798, 5; 967, 5] 144 30,6 Примечание. ЭДЧ - эквивалентная доза человека, рассчитана по формуле ЭДЧ = доза животного/k, где к для морской свинки 4,7. Характеристика экс эиментальных групп Животные общим числом 20 рандомизированы при помощи приложения для рандомизации британского национального центра по замене, усовершенствования и уменьшения использования животных в исследованиях (National center for the Replacement, Refinment & Reduction of Animals in Research, UK). Таким образом, животные были разделены на 4 группы: контрольная группа получала 10%-й сахарнокрахмальный сироп, I группа получала 2,5%-й сахарнокрахмальный сироп риамиловира (48 мг/кг), II и III группы получали 4%-й сахарно-крахмальный сироп риамиловира в разных объемах (96 и 144 мг/кг соответственно). Субстанция риамиловира (партия № 15117) производства ООО «Завод Медсинтез» (Российская Федерация). Для удобства доставки животным композиция в объеме 2 мл помещалась в шприцы с удаленными иглами;препарат хранился не более 7 дней при температуре 2-4 °С. Характеристика экспериментальных групп представлена в табл. 1. Сироп вводился животным перорально за зубной ряд через короткий зонд, надеваемый на шприц, ежедневно в одно и то же время. В течение эксперимента каждое животное осматривалось ежедневно, оценивались: активность, общее состояние животных, изменения шерсти, наличие диареи и кровотечений. Забор крови производился трижды после 14-15-часового голодания: до начала эксперимента (0-й день), на 33-й и 65-й дни эксперимента. Биохимическая панель включала: аспартатами-нотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), общий и свободный билирубин, гамма-глутамил-трансфераза (ГГТ), общий холестерин, триглицериды, общий белок. Кровь забиралась при помощи вакуумной системы забора крови VACUETTE® из полости сердца, в пробирки VACUETTE® с гелем и активатором свертывания [5]. Во время забора крови животные находились под общей анестезией, которая выполнялась с помощью лекарственных препаратов «Золетил 100» (Тилетамин) и «Ксила» 2 % (Ксилазин), анестезиологическое пособие оказывалось врачом-ветеринаром. Биохимический анализ производился на автоматическом биохимическом и иммуноферментном анализаторе ChemWell (Awareness Technologi, США) с использованием реактивов ООО «Ольвекс-Диа-гностикум». После окончания 8-недельного периода введения препарата (на 65-й день) животные выводились из эксперимента при помощи эфирного наркоза. Полученные результаты обрабатывали с использованием пакета программ Statistica 13.0 (StatSoft, США). Алгоритм статистического анализа включал этап определения медианы, 25 и 75 процентиля. Сравнение полученных результатов проводилось при помощи непараметрического критерия Фридмана, разницу принимали как статистически значимую при p < 0,05. Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России (протокол № 10 от 16.12.2016). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На протяжении всего исследования ни в одной экспериментальной группе отклонений в состоянии здоровья животных обнаружено не было. У всех морских свинок была чистая, ухоженная шкурка, видимые слизистые и кожные покровы имели физиологическую окраску, экзофтальма не было. Диарея и кровотечения не зафиксированы. При сравнении значений полученных биохимических показателей (табл. 2) при помощи критерия Фридмана статистически значимых изменений значений АЛТ, АСТ, ГГТ, общего и свободного билирубина, триглицеридов и общего белка не было получено. Для оценки гепатоцеллюлярного повреждения достаточно двух маркеров из перечисленных: АЛТ, АСТ, сорбитолдегидрогеназа или глутаматдегидрогеназа [7]. Как минимум два параметра из перечисленных необходимы для идентификации гепатобилиарного повреждения: щелочная фосфотаза, гамма-глутамил-трансфераза, 5-нуклеотидаза или общий билирубин [7]. Такие показатели, как общий белок, альбумин, холестерин, триглицериды используются как дополнительные параметры метаболической и синтетической функции печени. Стоит отметить, что снижение альбумина является отражением нарушением не только синтетической функции, но и маркером воспалительных процессов [9]. В исследовании было выявлено статистически значимое снижение альбумина во II группе с 45,7 [44, 3; 46, 25] г/л в начале эксперимента до 37,25 [36, 2; 39, 5] г/л на 65-й день (р = 0,018), и в III группе 44,95 [42, 8; 46, 15] г/л в начале эксперимента до 43,1 [40, 7; 44, 5] г/л на 65-й день (p = 0,039), статистически значимое сниже-ни е холестерина во II группе с 1,33 ммоль/л [1, 16; 1, 4] в начале эксперимента до 0,9 ммоль/л [0, 69; 1, 0] на 65-й день (p = 0,049), при этом его уровень остался в границах нормы (норма холестерина для морских свинок составляет 0,5-2,0 ммоль/л) [8]. Также было выявлено снижение альбумина во II группе животных на 8,45 г/л (p = 0,018), с 45,7 г/л в начале эксперимента до 37,25 г/л на 65-й день и в III группе животных на 1,85 г/л (р = 0,039), с 44,95 г/л в начале эксперимента до 43,1 г/л. Значение альбумина также осталось в границах нормального значения (норма альбумина для морских свинок 20-50 г/л) [10]. Не было зарегистрировано снижения общего белка во II группе, что может свидетельствовать об относительном снижении уровня альбумина и повышении уровня провоспалительных белков, в том числе глобулина. Воспалительные цитокины, в том числе интерлейкин-1, фактор некроза опухолей, интерферон, стимулируют синтез белков воспалительных белков, что приводит к относительному снижению альбумина [9]. Также стоит отметить, что отсутствовали изменения в III группе животных, получавших максимальную дозировку риамиловира. Вероятнее всего, это связано с физико-химическими свойствами соли риамиловира, которая обладает плохой растворимостью. Возможно, в концентрации 144 мг/кг препарат плохо всасывается при пероральном введении. Таблица 2 Показатель Группа День эксперимента р, критерий Фридмана 0 33 65 АЛТ, Ед./л Контроль 25,0 [21, 7; 27, 1] 35,5 [29, 4; 35, 5] 45,2 [27, 1; 53, 7] 0,09 I группа 39,85 [25, 7; 53, 6] 35,65 [28, 6; 45, 4] 29,25 [24, 1; 38, 9] 0,77 II группа 33,1 [24, 1; 35, 0] 28,25 [35, 7; 40, 5] 46,65 [30, 9; 61, 7] 0,17 III группа 37,5 [31, 8; 45, 6] 43,5 [35, 7; 57, 8] 54,85 [40, 0; 67, 0] 0,47 АСТ, Ед./л Контроль 30,8 [22, 6; 48, 5] 44,3 [29, 1; 61, 1] 88,6 [41, 3; 107, 3] 0,26 I группа 26,35 [21, 1; 63, 7] 43,15 [30, 6; 59, 5] 55,9 [36, 4; 77, 3] 0,77 II группа 38,65 [26, 0; 50, 9] 46,5 [28, 8; 56, 4] 33,3 [31, 6; 35, 3] 0,62 III группа 49,15 [33, 0; 63, 5] 48,6 [46, 0; 53, 2] 65,45 [37, 9;102, 6] 0,47 Динамика биохимических показателей (медиана, 25-й и 75-й процентили)* Окончание табл. 2 Показатель Группа День эксперимента р, критерий Фридмана 0 33 65 ГГТ, Ед./л Контроль 6,46 [5, 8; 10, 6] 6,46 [4, 1; 6, 46] 7,08 [4, 7; 23, 0] 0,71 I группа 6,1 [5, 0; 11, 4] 7,24 [6, 61; 8, 0] 9,0 [7, 77; 10, 0] 0,62 II группа 7,0 [5, 9; 9, 5] 7,0 [5, 6; 8, 6] 6,78 [5, 95; 14, 0] 0,77 III группа 9,0 [7, 5; 10, 1] 7,4 [6, 6; 8, 0] 8,5 [7, 6; 10, 5] 0,36 Билирубин общий, мкмоль/л Контроль 8,96 [6, 0; 9, 12] 5,75 [3, 95; 8, 22] 7,4 [7, 07; 10, 2] 0,71 I группа 7,4 [5, 75; 16, 0] 4,77 [2, 4; 8, 5] 6,37 [3, 08; 10, 2] 1,0 II группа 9,865 [5, 5; 13, 35] 4,11 [3, 0; 8, 4] 5,75 [3, 5; 19, 1] 0,08 III группа 11,47 [4, 93; 18, 8] 8,22 [6, 2; 8, 26] 7,6 [5, 3; 12, 45] 1,0 Билирубин свободный, мкмоль/л К о нтроль 1,89 [1, 64; 2, 2] 1,46 [1, 1; 1, 48] 1,91 [1, 81; 3, 11] 0,051 I группа 1,69 [0, 9; 4, 15] 1,35 [1, 1;1, 89] 1,64 [1, 08; 2, 5] 1,0 II группа 2,09 [1, 47; 2, 8] 1,32 [0, 87; 2, 1] 1,54 [1, 1; 4, 3] 0,17 III группа 2,76 [1, 74; 4, 06] 1,46 [1, 1; 1, 8] 2,11 [1, 36; 3, 1] 0,17 ТГ, ммоль/л Контроль 1,15 [1, 02; 1, 56] 1,76 [1, 72; 2, 9] 2,2 [1, 68; 2, 26] 0,09 I группа 1,25 [0, 9; 1, 7] 1,0 [0, 86; 1, 72] 1,46 [0, 9; 1, 9] 0,07 II группа 0,93 [0, 89; 1, 5] 1,51 [0, 88; 2, 2] 1,68 [1, 5; 1, 97] 0,36 III группа 2,665 [1, 94; 3, 08] 1,77 [1, 4; 2, 5] 1,9 [1, 2; 2, 53] 0,47 ХС, ммоль/л Контроль 0,97 [0, 81; 0, 99] 1,06 [0, 85; 1, 18] 0,84 [0, 81; 0, 9] 0,26 I группа 1,01 [0, 83; 1, 14] 0,94 [0, 79; 1, 2] 0,705 [0, 65; 0, 94] 0,36 II группа 1,33 [1, 16; 1, 4] 1,22 [0, 9; 1, 4] 0,9 [0, 69; 1, 0] 0,049 III группа 1,05 [0, 82; 1, 27] 0,96 [0, 81; 1, 21] 1,13 [0, 98; 1, 18] 0,47 Общий белок, г/л Контроль 51,3 [43, 1; 61, 5] 59,5 [57, 4; 60, 9] 58,6 [53, 0; 63, 6] 0,36 I группа 58,0 [56, 7; 58, 7] 57,25 [54, 2; 58, 1] 51,55 [43, 4; 58, 6] 0,17 II группа 59,2 [58, 4; 60, 3] 57,95 [57, 4; 58, 8] 54,95 [54, 6; 57, 3] 0,17 III группа 58,45 [56, 4; 59, 0] 57,6 [53, 6; 59, 8] 57,6 [53, 6; 59, 8] 0,17 Альбумин, г/л Контроль 40,1 [35, 1; 49, 9] 46,0 [45, 9; 46, 8] 41,6 [38, 8; 44, 9] 0,26 I группа 43,9 [42, 3; 45, 7] 44,5 [42, 9; 46, 0] 37,3 [32, 9; 42, 3] 0,36 II группа 45,7 [44, 3; 46, 2] 43,0 [40, 4; 45, 7] 37,25 [36, 2; 39, 5] 0,018 III группа 44,95 [42, 8; 46, 1] 55,9 [54, 3; 57, 7] 43,1 [40, 7; 44, 5] 0,039 * Различия значимы при р < 0,05. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Противовирусный препарат «Риамиловир» не вызывает гепатоцеллюлярного и гепатобилиарного повреждения при многократном введении в дозировках 48, 96, 144 мг/кг в течение 64 дней (8 недель). Возможно функциональное изменение синтетической функции печени при ежедневном введении риамиловира в течение 8 недель в дозировках 96 и 144 мг/кг

Об авторах

Ксения Дмитриевна Федулова

ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: fedulova.k.d@gmail.com
ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии Екатеринбург

Н. В Изможерова

ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра фармакологии и клинической фармакологии Екатеринбург

А. Ю Петров

ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра фармации и химии Екатеринбург

И. В Гаврилов

ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра биохимии Екатеринбург

Н. В Словеснова

ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра фармации и химии Екатеринбург

Список литературы

Дополнительные файлы