Helminths infestation of various mitochondrial lines of the sable Martes Zibellina and the pine marten M. MARTES

Full Text

В настоящее время анализ изменчивости митохондриальной ДНК (мтДНК) широко используется в области эволюционной и популяционной генетики животных. Использование этого подхода к анализу филетических связей куньих позволило установить, что у соболя Martes zibellina (Linnaeus, 1758) существует три древние линии гаплотипов, которые обособились в плейстоцене [11]. В последующем они быстро распространились на большую территорию от Дальнего Востока до Фенноскандии [9]. На Северном Урале и в Западной Сибири на протяжении длительного исторического периода имела и имеет место гибридизация соболя с сестринским видом - лесной куницей Martes martes (Linnaeus, 1758), сопровождающаяся взаимной интрогрессией мтДНК [14, 18]. При гибридизации митохондриальный геном, наследующийся без рекомбинации, сохраняется из поколения в поколение как маркер гибридизации, имевшей место в прошлом. В Западной Сибири в последние годы наблюдается рост численности соболя и расширение его ареала в более южные районы, где он был истреблен еще в XVIII в. Этот процесс сопровождается сокращением доли типичных и увеличением числа гибридных животных. Причины и последствия гибридизации не изучены и вызывают большой интерес исследователей. С одной стотроны, гибридизация, особенно межвидовая, ведет к разрушению коадаптированных генных комплексов, в результате чего гибридные комбинации генов могут оказаться инадаптивными. С другой стороны, гибридные особи, имеющие гаплотип другого вида, могут иметь селективное преимущество на границе ареала своего вида [7]. Это преимущество может быть обусловлено в том числе и устойчивостью к паразитарной инвазии, поскольку паразиты, так же как и хозяева, могут быть представлены несколькими филетическими линиями, которые нередко коэволюционируют совместно с хозяевами [13]. Известно, что в Западной Сибири существует мощный очаг филяроидоза куньих. В этом очаге у зараженных соболей в 2,5 раза сокращается средняя продолжительность жизни, в 1,5-2,8 раза возрастает уровень общей смертности, снижается плодовитость самок [12]. У инвазированных животных в бронхах развивается катаральный процесс, возникает очаговая эмфизема [4]. Филяроидоз может оказывать существенное влияние на выживаемость куньих [2]. Устойчивость к паразитарной инвазии может служить фактором естественного отбора и обеспечивать селективное преимущество особей с определенными генотипами. В связи с этим интерес представляет сравнение зараженности гибридных особей с родительскими видами. Цель исследования - изучение зараженности гельминтами разных митохондриальных линий соболя и лесной куницы в Западной Сибири. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Материалом для исследования служили тушки соболя и лесной куницы, добытые охотниками в ходе лицензионного промысла в зимний период 2009-2014 гг. в ряде районов Западной Сибири (рис. 1). Всего было исследовано 166 особей, в том числе 100 соболей, 20 лесных куниц, а также 46 атипичных соболей и лесных куниц, которые представляют собой результат древней и современной интрогрессивной гибридизации. Идентификацию гибридов производили на основе дискриминантного анализа краниометрических признаков [1], а также генетическими методами [18, 19]. Все животные были половозрелые, от 2 лет и старше. Поскольку в исследованиях, проведенных ранее [6], не было выявлено статистически значимых различий в зараженности самок и самцов гельминтами, в данной работе при расчете показателей зараженности животных не дифференцировали по полу. ДНК экстрагировали из сердечной мышечной ткани, фиксированной в 70 % этаноле, с использованием набора для выделения ДНК Diatom® DNA Prep100 (ООО «Лаборатория Изоген», г. Москва). Полиморфизм митохондриального гена цитохрома b изучали методом RFLP (от англ. Restriction Fragment Length Polymorphism), который основан на мутационных заменах в сайтах узнавания рестриктаз. Для рестрикционного анализа гена цитохрома b мтДНК использовали последовательности праймеров из работы [8] и эндонуклеазы HaeIII, BstNI, TaqI, RsaI, имеющие сайты рестрикции в анализируемом участке митохондриального генома как соболя, так и лесной куницы [10]. ПЦР фрагмента гена цитохрома b mtДНК длиной 1300 п. н. проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей IQ supermix (Bio-Rad), 3 мкл тотальной ДНК и 2,5 мкл каждого из праймеров, на амплификаторе DNA Engine Dyad® и Chromo-4 (Bio-Rad) в следующем режиме: 94 ºС - 5 мин; затем 33 цикла 94 ºС - 1 мин, 51 ºС - 1 мин, 72 ºС - 1 мин 45 с; 72 ºС - 2 мин. Электрофоретическое разделение рестрикционных фрагментов проводили в 2,5 % агарозном геле. Длины фрагментов определяли с помощью маркера молекулярных масс ДНК GeneRuler™ DNA Ladder mix (Fermentas, Литва). Для определения зараженности гельминтами проводили вскрытие желудочно-кишечного тракта и легких с применением методик последовательного промывания и компрессирования. Видовая идентификация гельминтов осуществлялась с использованием определителя [3]. Рассчитывали показатели зараженности: экстенсивность инвазии (ЭИ) - доля зараженных животных по отношению к числу исследованных,%; интенсивность инвазии (ИИ) - количество гельминтов в одной зараженной особи; индекс обилия (ИО) - среднее количество паразитов на одну исследованную особь хозяина. Для сравнения зараженности разных групп животных использовали статистические сравнения по t-критерию Стьюдента, а также F-критерий Фишера в рамках дисперсионного анализа (ANOVA) и регрессионный анализ. Валидность использования t-критерия и дисперсионного анализа подтверждена оценкой нормальности распределения и равенством дисперсий в сравниваемых группах. Дисперсионный анализ проводили как по отдельным видам гельминтов, так по суммарной зараженности нематодами в зависимости от гаплотипа, а также от принадлежности к виду (соболь, лесная куница) или группе гибридов. Регрессионный анализ проводили с использованием скорректированного коэффициента детерминации (adjusted R2) и бета-коэффициентов, показывающих вклад каждой из независимых переменных в предикцию, для факторов «гаплотип» и «вид/гибриды». Для статистической обработки данных использовали компьютерную программу Statistica 6.0 (1998). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В результате рестрикционного анализа мтДНК куньих было выделено 9 комплексных гаплотипов (табл. 1). Гаплотипы Z28, Z30 и Z31 соответствуют линиям А, В и С в популяциях соболя Дальнего Востока [8]. В Западной Сибири помимо трех вышеописанных обнаружены также новые гаплотипы. Гаплотип Z5 соответствует комплексному гаплотипу СВАB, АК23 - комплексному гаплотипу ААСA, АК29 - BBAB, АС27 - СВВB, UC1 - AABA для последовательности рестриктаз HaeIII, BstNI, TaqI, RsaI. Гаплотипы Z5, Z30 и АК23 являются общими для западносибирского подвида соболя и лесной куницы, хотя встречаются у них с разной частотой. У соболя преобладают гаплотипы Z30 и Z31, у лесной куницы - АК29 и Z5, у кидуса - Z30 и АК23. Остальные гаплотипы встречались у единичных особей. Комплексный гаплотип UC1 характерен для соболя Северного Урала и не встречается ни в Западной, ни в Восточной Сибири. Гаплотип Z28 (А), широко распространенный в популяциях соболя Дальнего Востока и Восточной Сибири, в западносибирских популяциях куньих встречается редко. Сами по себе мутационные замены в гене митохондриального цитохрома b могут быть и нейтральны, но они маркируют разные линии гаплотипов и, следовательно, разные по происхождению группировки куньих. У животных, длительное время обитающих на территории природных очагов, вырабатывается толерантность к местным паразитам. У пришлых животных такой толерантности нет. Учитывая разные ареалы становления видов соболя и лесной куницы, они должны быть приспособлены к разным видам гельминтов. В результате гельминтологического исследования желудочно-кишечного тракта и легких соболя и лесной куницы было обнаружено 4 вида нематод. В кишечнике были обнаружены Capillaria putorii (Rudolphi, 1819) и Strongyloides martis (Petrov, 1940), в легких - Crenosoma petrovi (Morosov, 1939) и Filaroides martis (Werner, 1782). В зависимости от района исследования показатели зараженности животных нематодами варьировали в широких пределах: экстенсивность инвазии - от 14 до 95 %, интенсивность инвазии - от 9 до 306 на одно животное (табл. 2). Как правило, у симпатрически обитающих видов куньих гельминтофауна различается из-за особенностей их экологии и различий в спектре питания [15]. Видовой состав гельминтов был одинаков у соболя и лесной куницы, что свидетельствует о значительном перекрывании их экологических ниш. Но лесная куница была заражена нематодами F. martes и S. martis статистически значимо больше, чем соболь (табл. 3). Более высокая зараженность нематодами куницы по сравнению с соболем может быть обусловлена различиями в биологии сравниваемых видов [5], а также ее преимущественным обитанием в более южных (подтаежных) районах, где зараженность нематодами выше [17]. Гибриды соболя и лесной куницы имели промежуточный уровень инвазии по сравнению с родительскими видами (табл. 3). Мы сравнили зараженность нематодами животных с разными гаплотипами мтДНК. Редко встречающиеся гаплотипы (обнаруженные у единичных особей) были исключены из анализа. Однофакторный дисперсионный анализ показал статистически значимую зависимость суммарной зараженности нематодами от гаплотипа (F = 2,90, p = 0,048). По зараженности нематодами более инвазированными были куньи с гаплотипом Z31 (рис. 2). Суммарная зараженность гельминтами особей этой линии превышала зараженность особей линий Z30 и Z5 в 2 раза, а животных линии AK23 - в 4 раза (табл. 4). Гаплотип Z31, обладатели которого характеризуются наибольшей восприимчивостью к нематодной инвазии, характерен для соболя, не встречается у лесной куницы, но с небольшой частотой обнаруживается у их гибридов. Помимо западносибирского соболя этот гаплотип обнаружен также у баргузинского соболя [18]. Известно, что в XX в. восстановление численности западносибирских популяций соболя происходило за счет реинтродукции баргузинского подвида, наиболее ценного в пушном отношении. Возможно, гаплотип Z31 маркирует митохондриальные линии этих восточных соболей, а также линии, сформировавшиеся как результат их недавней интрогрессивной гибридизации с местным соболем. Высокая восприимчивость к инвазии животных этой линии могла бы объяснить небольшую частоту встречаемости этого гаплотипа в современных популяциях соболя Западной Сибири, а также тот факт, что, несмотря на завоз большого числа особей баргузинского подвида, не удалось сформировать местные популяции соболя с темной окраской меха. Наименьшей восприимчивостью к нематодной инвазии обладают особи с гаплотипом AK23. Этот гаплотип встречается с небольшой частотой у лесной куницы (10 %) и соболя (5,2 %), но наиболее характерен для кидусов (32,6 %). Гаплотип AK23 (AACA) является производным от гаплотипа UC1 (AABA), характерного для соболя Урала, и Z28 (AAAA) - древней «соболиной» линии, наиболее распространенной в Восточной Сибири. Большое распространение этого гаплотипа среди куньих, а также связь с древними гаплотипами указывают на древность этой митохондриальной линии и давность самого факта интрогрессивной гибридизации. Множественный регрессионный анализ зараженности гельминтами от гаплотипа и видовой принадлежности показал больший вклад второго фактора - принадлежности к виду или гибридной группе. Бета-коэффициент для фактора «гаплотип» составил 0,15, для фактора «вид/гибрид» - 0,36. Статистически значимые значения получены только для суммарной зараженности нематодами (adjusted R2 = 0,109, p = 0,047). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Различия в зараженности нематодами животных с разными гаплотипами мтДНК свидетельствуют о том, что разные филетические линии куньих обладают разной степенью восприимчивости к нематодной инвазии. Лесная куница заражена нематодами сильнее, чем соболь, а гибриды имеют промежуточные показатели инвазии.

About the authors

Oxana N Zhigileva

Tyumen State University

Email: zhigileva@mail.ru
associate professor, Ph.D, Department of Ecology and Genetics

Inna M Uslamina

Tyumen State University

Email: inna_golovacheva@mail.ru
postgraduate, Department of Ecology and Genetics

References

Supplementary files