Том 22, № 1 (2024)
- Год: 2024
- Выпуск опубликован: 14.05.2024
- Статей: 8
- URL: https://journals.eco-vector.com/ecolgenet/issue/view/8200
- DOI: https://doi.org/10.17816/ecogen.221
От редакции
Третья Международная конференция «ГМО: история, достижения, социальные и экологические риски»
Аннотация
С 3 по 5 октября 2023 г. в Санкт-Петербургском государственном университете в рамках реализации Программы создания и развития Научного центра мирового уровня «Агротехнологии будущего» прошла Третья Международная конференция «ГМО: история, достижения, социальные и экологические риски». В этом выпуске представлены материалы избранных докладов конференции, посвященной 300-летнему юбилею Санкт-Петербургского государственного университета.
Генетические основы эволюции экосистем
CRISPR/Cas-редактирование гена CPC у Arabidopsis thaliana
Аннотация
Актуальность. Идентификация генов-мишеней, обеспечивающих видимый фенотипический эффект, может способствовать разработке стратегий бесследного геномного редактирования и использованию получаемых сортов сельскохозяйственных культур в сельском хозяйстве. CAPRICE (CPC) представляет собой одноповторный транскрипционный фактор R3 MYB, участвующий в биосинтезе антоцианов и образовании трихом. Предположительно, CPC контролирует экспрессию дигидрофлавонол-4-редуктазы (DFR) — ключевого гена биосинтеза антоцианов.
Цель — определить, приводит ли нокаут гена CPC с помощью CRISPR/Cas9 к видимому накоплению антоцианов.
Материалы и методы. Для вырезания домена MYB из гена CPC Arabidopsis thaliana были подобраны 3 направляющие РНК. В редактированных растениях изучали содержание антоцианов и экспрессию генов CPC и DFR.
Результаты. Ожидаемая делеция 662 п. н. была обнаружена у 2,7 % устойчивых к глюфосинату растений, однако ни одна из мутаций не была гомозиготной. Четыре отредактированные линии были изучены в четырех поколениях. В отредактированных линиях наблюдалась активация гена DFR, однако по экспрессии гена CPC, содержанию антоцианов и развитию трихом они существенно не отличались от контрольных растений. Более того, у A. thaliana пигментация не зависела напрямую от экспрессии генов DFR или CPC.
Заключение. Наши результаты демонстрируют, что ген CPC участвует в регуляции экспрессии гена DFR и пути биосинтеза антоцианов, однако при появлении мутаций растения могут использовать другие факторы транскрипции для поддержания гомеостаза. Таким образом, ген CPC арабидопсиса не является подходящей мишенью для исследований системы CRISPR/Cas.
Биохимическая характеристика трансформированных корней Pisum sativum L. subsp. sativum var. Sativum с модифицированным морфотипом листа
Аннотация
Актуальность. В литературных источниках данные об успешном получении высокобелковых корневых культур гороха с мутантными аллелями tl и af tl и их биохимическая характеристика не представлены.
Цель — биохимическая характеристика полученных трансформированных культур мутантных линий гороха с модифицированным морфотипом листа. Задачи исследований: уточнение состава генов rol трансформированных культур гороха дикими штаммами Agrobacterium rhizogenes и аминокислотный анализ общего белка полученных культур.
Материалы и методы. Тотальная ДНК была выделена из культуры корней мутантов гороха. Исследования выполнены на оборудовании термоциклер «Терцик» фирмы «ДНК-Технология» (Россия). Выявление ампликонов проводили методом электрофореза в 2 % агарозном геле. Гель визуализировали и фотографировали в ультрафиолетовом излучении (λ = 312 нм). Количественный и качественный аминокислотный состав корневых культур определяли методом ионообменной хроматографии на аминокислотном анализаторе ААА-339 (Microtechna, Чехия).
Результаты. Методом ПЦР выявлено отсутствие агробактериальной контаминации в трансформированных культурах и их стабильный рост на жидких и агаризованных безгормональных средах в течение 5 лет. ПЦР-анализ показал наличие двух генов rol C и D в культуре с генотипом tltl и четырех генов rol A, B, C и D в культуре с генотипом afaftltl. Обнаружено дифференцированное содержание ряда аминокислот в биомассе трансформированных культур в зависимости от генотипа культуры и вставок генов rol. Выявлены семь незаменимых аминокислот в обеих культурах. Лимитирующей незаменимой аминокислотой для обеих культур оказался триптофан.
Вывод. По содержанию суммы незаменимых, кетогенных и серосодержащих аминокислот корневая культура с генами rol A, B, C, D оказалась наиболее богатой и сбалансированной.
Взаимодействие гомеодомена транскрипционного фактора WOX4 Raphanus sativus с промотором гена биосинтеза цитокининов LOG3
Аннотация
Транскрипционный фактор WOX4 — ключевой регулятор развития камбия, однако к настоящему времени нет данных о его прямых мишенях. В задачи нашей работы входило изучение влияния сверхэкспрессии гена RsWOX4-2 на развитие корня и экспрессии генов у редиса (Raphanus sativus L.) — модельного корнеплодного растения, родственного Arabidopsis thaliana, а также поиск вероятных прямых мишеней транскрипционного фактора RsWOX4-2. Сверхэкспрессия и РНК-интерференция RsWOX4-2 вызывает изменение уровней экспрессии ряда генов, промоторы которых содержат консервативные сайты связывания транскрипционных факторов семейства WOX. С помощью дрожжевой одногибридной системы мы показали, что ДНК-связывающий гомеодомен RsWOX4-2 взаимодействует с сайтом TAATCC в промоторе гена RsLOG3, который кодирует фермент биосинтеза цитокининов.
Трансгенез микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii: актуальные подходы
Аннотация
Микроводоросли — богатый источник биологически активных веществ природного происхождения, которые находят применение в фармацевтическом, сельскохозяйственном, пищевом и промышленном производстве. Генетическая инженерия микроводорослей открывает большие возможности для создания штаммов-продуцентов различных пищевых добавок, коммерческих ферментов, а также белков терапевтического назначения — антител, гормонов и вакцин. Одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii P.A. Dang. — модельный объект генетики фотосинтеза — оказалась удобной для разработки новых подходов в генетической инженерии микроводорослей. Преимущества C. reinhardtii состоят в возможности трансформации всех трех ее геномов (ядерного, митохондриального и хлоропластного), низкой стоимости и простоте культивирования, безопасности для человека и наличии системы посттрансляционной модификации белков, что делает этот организм потенциально интересной платформой для применения в биотехнологии. За последние несколько лет были достигнуты значительные успехи в трансгенезе C. reinhardtii, в том числе с применением новых методик редактирования генома. В этом обзоре мы представляем данные о современных достижениях в области модификации генома одноклеточной зеленой водоросли C. reinhardtii: принципы дизайна трансгенных конструкций, методики трансформации ядерного и хлоропластного геномов, используемые селективные маркеры и подходы к редактированию геномов с помощью системы CRISPR/Cas9.
Методология экологической генетики
Разработка подходов для геномного редактирования растений гороха с использованием технологии CRISPR/Cas9
Аннотация
Митоген-активируемые протеинкиназы (МАРК) являются важными внутриклеточными регуляторами сигнальных путей у растений. Установлено, что некоторые МАРК активируются в корнях бобовых растений при симбиозе с азотфиксирующими бактериями — ризобиями. Один из таких сигнальных регуляторов — MAPK6, которая участвует в развитии симбиоза растений гороха посевного Pisum sativum L. с ризобиями. С использованием генно-инженерных подходов была осуществлена сверхэкспрессия гена PsMAPK6 в трансгенных корнях гороха, что привело к увеличению количества клубеньков и биомассы растений. Мы разработали новые подходы для редактирования генома гороха с использованием технологии CRISPR/Cas9 первичного редактирования (prime editing), когда в качестве мишени использовали ген PsMAPK6. При анализе трансгенных корней гороха в геноме трансформантов был выявлен ген, кодирующий последовательность направляющей РНК Cas9 (pegRNA, от англ. prime-editing guide RNA). Возможность использования методов генной инженерии для получения растений с повышенной эффективностью симбиоза является перспективной для дальнейших экспериментов.
Методы «прогулки по геному» на основе ПЦР (обзор)
Аннотация
В обзоре рассматриваются ряд классических и современных методов, позволяющих установить нуклеотидную последовательность неизвестных участков ДНК, фланкирующих известные. Они применяются для расшифровки регуляторных областей генов, определения сайтов встраивания Т-ДНК или вирусов и т. д., в тех случаях, когда использование полногеномного секвенирования неоправданно. Чтобы амплифицировать участок ДНК, к концу неизвестной последовательность необходимо добавить участок связывания для праймера; это реализуется либо путем лигирования адаптера, либо посадкой вырожденного праймера в мягких условиях, либо закольцовыванием фрагмента ДНК, чтобы изучаемый участок оказался окружен известными. Второй важной задачей является избавление от неизбежно возникающих продуктов неспецифического связывания адаптеров либо вырожденных праймеров — чаще всего данная проблема разрешается несколькими раундами вложенной ПЦР. Разные методы существенно отличаются по трудоемкости, распространенности и доступности необходимых реактивов.
Постпубликационные изменения
Ошибка в статье «The strong base for using base editing in plants» (doi: 10.17816/ecogen567885)
Аннотация
Редакция сожалеет, что в опубликованной версии тезиса доклада произведения инициал отчества автора М. Лебедевой был указан как А вместо В. Имя автора — Лебедева Марина Валерьевна. Редакция уверена, что допущенная ошибка не могла существенно повлиять на восприятие произведения и интерпретацию информации читателями. В электронной форме на сайте журнала ошибка исправлена, файл статьи и выпуска обновлены.