Анализ противоопухолевой активности радиофармацевтического лекарственного препарата на основе биспецифических антител к элементам опухоль-ассоциированной стромы и изотопа лютеция 177

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Интенсивное развитие иммунологии, структурной биологии и радиохимии, создание эффективных биотехнологических и радиофармацевтических производств по стандартам GMP, сформировали необходимые предпосылки для разработки и внедрения в клиническую практику принципиально новых классов радиофармацевтических лекарственных препаратов (РФЛП) на основе высокоселективных нацеливающих молекул, как правило, иммунобиологической природы, и радионуклидов с различным спектром излучения [18, 19]. Применение таргетных РФЛП, особенно препаратов на основе радионуклидов — источников α- или β-излучения, открывает широкие перспективы для терапии злокачественных новообразований, маловосприимчивых к традиционным видам противоопухолевого лечения, прежде всего за счет очень избирательной локализации в области опухолевого процесса большого количества радиоактивных элементов, обладающих неселективным цитопатологическим действием [6, 10, 13, 15]. Это в значительной степени увеличивает вариативность тактики лечения и ее эффективность. Таргетный характер механизма действия РФЛП также имеет и косвенное защитное значение для интактных органов и тканей организма, уменьшая системное токсическое действие препарата [3, 9, 11].

Различные иммунобиологические лекарственные препараты с таргетным действием давно и успешно применяются в терапии большого количества заболеваний, в том числе, онкологических [2, 4, 5, 14, 16, 18]. При этом арсенал РФЛП с каждым годом становится обширнее, совершенствуются технологии разработки и производства препаратов и их компонентов (молекул-носителей, радионуклидов, хелатирующих комплексов, вспомогательных соединений).

Цель — экспериментальная оценка противоопухолевой активности нового РФЛП на основе изотопа ¹⁷⁷Lu и комплексного таргетного носителя — биспецифического антитела, объединяющего мембранный гликопротеин 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA4) и мембранный протеин, рецептор группы фактора некроза опухоли (GITR). Уникальность разработки определяется именно свойствами антитела, способного селективно связываться с консервативными (не подверженными опухолевой прогрессии) молекулами-мишенями микроокружения новообразования. Способность РФЛП взаимодействовать именно с мишенями стромы опухоли, теоретически, позволяет рассматривать препарат в качестве терапевтического агента против злокачественных опухолей различного исходного гистологического типа и локализации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводилось на 15 самцах лабораторных мышей линии BALB/c, полученных из специализированного питомника лабораторных животных ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук» (ИЦиГ СО РАН). Карантинный период для поступивших мышей составлял 14 сут, после чего животные поступали в основное отделение вивария. Содержание мышей, кормление, поддержание микроклимата в помещениях вивария соответствовали правилам, действующим в мировой и отечественной практике [1]. Проведение эксперимента было согласовано Комиссией по биоэтике НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ (заключение № 04/1-КПБ-21 от 16 апреля 2021 г.).

Тестируемый РФЛП — ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR — был разработан ФГБУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий им. акад. А.М. Гранова» Минздрава России. Препарат представлял собой прозрачный раствор, 1 мл которого содержал 0,1 мг таргетного антитела; активность ¹⁷⁷Lu составляла не менее 1,5 МБк.

Для моделирования опухолевого процесса использовали клон экспериментальной аденокарциномы толстой кишки мышей (клеточная линия — CT26 EGFR) из коллекции НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ. Патогенез оцениваемой в ходе исследования опухоли максимально близок к клинической картине целевого заболевания — колоректального рака у человека. Опухоль обладает высокими темпами роста, значительным инвазивным потенциалом, удовлетворительной интенсивностью метастазирования как по лимфогенному (основной способ), так и по гематогенному (преимущественно в печень) механизмам и широко применяется в фундаментальных и доклинических экспериментах [7, 12, 20, 21]. Трансплантацию злокачественных клеток подопытным животным производили в дозе 10⁶ клеток/особь путем инъекции в подкожную клетчатку правого бока. В исследование был взят опухолевой материал от животных-доноров со второго пассажа новообразования, после патоморфологической и иммуногистохимической оценки опухоли. Было показано, что в опухолевой ткани содержится удовлетворительный уровень целевых молекул-мишеней для терапии. Ранее, в ходе предварительных исследований, нами было показано, что тестируемый препарат ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR способен удовлетворительно накапливается в ткани оцениваемого новообразования [8, 17].

Были сформированы три экспериментальные группы:

• группа 1 (n = 5) — оценка основных показателей роста и развития новообразования у мышей с трансплантированной опухолью;
• группа 2 (n = 5) — оценка противоопухолевой активности (функциональной пригодности) тестируемого препарата при однократном введении;
• группа 3 (n = 5) — оценка противоопухолевой активности (функциональной пригодности) тестируемого препарата при двукратном введении (интервал 7 сут).

С учетом темпов развития экспериментальной аденокарциномы толстой кишки у мышей терапию осуществляли по двум схемам:

1. Однократное применение тестируемого препарата через 48 ч после трансплантации новообразования в дозе 5 МБк/мышь (группа 2).
2. Двукратное (курсовое) применение тестируемого препарата через 48 и 216 ч после трансплантации новообразования в дозе 5 МБк/мышь (суммарная доза — 10 МБк/мышь; группа 3).

Раннее назначение терапии (до появления отчетливо различимого и пальпируемого первичного опухолевого узла), на наш взгляд, является оправданным с точки зрения возможной оценки влияния препарата на формирование микроокружения опухоли и длительность латентного периода развития, а также с точки зрения оценки возможности подавления лечением при помощи ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR микрометастазов опухоли.

Оценку эффективности тестируемого препарата производили общепринятым способом. Анализировали следующие показатели:

• длительность латентного периода развития трансплантированной опухоли (сутки до появления первичного опухолевого узла, пальпаторно);
• динамика роста опухолевого узла с расчетом показателей торможения опухолевого роста (мм³, %);
• средняя продолжительность жизни с расчетом показателя увеличения продолжительности жизни (сутки, %).

Величину первичного опухолевого узла оценивали методом измерения в трех взаимоперпендикулярных размерах; влияние отека тканей в перитуморальной области не учитывалось.

Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле:

ТРО (%) = [(V_{контроль} – V_{эксперимент}) / V_{контроль}] · 100 %,

где V — объем опухоли в первой и опытной группах соответственно. Клинически значимый уровень отличий — не менее 50 %.

Увеличение продолжительности жизни (УПЖ) рассчитывали по формуле:

УПЖ (%) = [СПЖ_{эксперимент} – СПЖ_{контроль}] / СПЖ_{контроль}] · 100 %,

где СПЖ — средняя продолжительность жизни животных в первой и опытной группах соответственно. Клинически значимый уровень — не менее 25 %.

Статистический анализ результатов исследования осуществляли при помощи программы SPSS (США). Полученные данные приведены в виде Me [Q₁–Q₃] (медиана и квартильный размах). Проверку характера распределения вариант в группах производили методом Колмогорова – Смирнова. Сравнение данных выборок — при помощи U-критерия Манна – Уитни, так как распределение вариант в выборочных совокупностях было отличным от нормального. Достоверным уровнем отличий считали вероятность не менее 95 % (р < 0,05), что является стандартом в медико-биологических исследованиях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Трансплантация опухолевых клеток экспериментальной аденокарциномы толстой кишки мышам линии BALB/c была успешной во всех обследованных случаях.

Результаты влияния терапии CT26 EGFR тестируемым препаратом на длительность латентного периода развития новообразования, регистрируемую в тесте «определение времени появления первичного опухолевого узла», приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Влияние препарата ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR на время появления первичного пальпируемого опухолевого узла у мышей линии BALB/с с трансплантированной CT26 EGFR (сутки от момента трансплантации новообразования; Me [Q₁–Q₃])

Table 1. The effect of ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR upon the time of primary palpable tumor node emergence in BALB/с mice with transplanted CT26 EGFR (days since the moment of tumor transplantation; Me [Q₁–Q₃])

Обследуемые группы / Experimental groups
Группа 1 (Контроль) / Group 1 (Control)	Группа 2 / Group 2	Группа 3 / Group 3
19 [16–21]	24 [18–25]	24 [24–27]*

*Отличие от средних показателей группы 1 достоверно на принятом уровне значимости, p < 0,05. *Difference from mean values in group 1 are valid, p < 0,05.

 

Согласно вышеприведенным данным, применяемая радионуклидная терапия оказывала значительное влияние на ранние этапы формирования новообразования, ингибируя рост опухоли. При этом существенных отличий во времени регистрации первичного опухолевого узла аденокарциномы толстой кишки между группами мышей, получавших препарат однократно или два раза, не выявлено (p > 0,05), хотя и отмечалось более выраженное подавление опухоли в латентном периоде при курсовом введении исследуемого препарата. Оцениваемый показатель в группе 3 статистически значимо превышал аналогичные значения группы 1 в среднем на 5 дней (табл. 1; р = 0,015).

Анализ результатов влияния тестируемого препарата на динамику роста первичного опухолевого узла представлен в табл. 2 и на рис. 1 и 2.

 

Рис. 1. Влияние однократного применения ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR на динамику роста опухолевого узла у мышей линии BALB/с с трансплантированной CT26 EGFR

Fig. 1. The effect of one-time introduction of ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR upon the dynamics of primary tumor node growth in BALB/с mice with transplanted CT26 EGFR

 

Рис. 2. Влияние курсового применения ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR на динамику роста опухолевого узла у мышей линии BALB/с с трансплантированной CT26 EGFR

Fig. 2. The effect of course introduction of ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR upon the dynamics of primary tumor node growth in BALB/с mice with transplanted CT26 EGFR

 

Таблица 2. Влияние препарата ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR на динамику роста опухолевого узла у мышей линии BALB/с с трансплантированной CT26 EGFR, мм³, Me [Q₁–Q₃]

Table 2. The effect of ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR upon the dynamics of primary tumor node growth in BALB/с mice with transplanted CT26 EGFR, mm³, Me [Q₁–Q₃]

Сутки / Day	Обследуемые группа / Experimental groups			ТРО / TGI
	Группа 1 / Group 1	Группа 2 / Group 2	Группа 3 / Group 3
20	12 [7–15]	3 [3–3]*	–	Группа 2 / Group 2 — 75 %
22	24 [12–45]	11 [4–18]	–	Группа 2 / Group 2 — 54 %
24	108 [96–144]	30 [17–45]*	6 [4–9]*	Группа 2 / Group 2 — 72 % Группа 3 / Group 3 — 94 %
26	216 [180–324]	84 [44–150]*	24 [18–30]*	Группа 2 / Group 2 — 61 % Группа 3 / Group 3 — 89 %
28	765 [594–936]	216 [140–360]*	51 [18–90]*	Группа 2 / Group 2 — 72 % Группа 3 / Group 3 — 93 %
30	–	432 [342–513]	138 [39–252]	–
32	–	693 [610–756]	396 [180–516]	–
34	–	898 [756–1040]	732 [336–1040]	–
36	–	–	1248 [1033–1632]	–

Примечание. ТРО — торможение роста опухоли; клинически значимый уровень отличий, >50 %. *Отличие от показателей контрольной группы достоверны на принятом уровне значимости, p < 0,05. Note. TGI — tumor growth inhibition; clinically significant level, >50 %. *Difference from mean values in control group are valid, p < 0.05.

 

Ингибирование латентного периода развития новообразования при применении тестируемого препарата закономерно достоверно способствовало более позднему и более медленному приросту массы опухолевого узла. Торможение роста опухоли было более выраженным на фоне курсового применения ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR по сравнению с его однократным введением подопытным животным.

Ингибирование латентной стадии опухолевого процесса и клинически значимое торможение опухолевого узла при терапии экспериментальной аденокарциномы толстой кишки у мышей тестируемым препаратом приводило к увеличению средних показателей продолжительности жизни мышей с трансплантированной аденокарциномой толстой кишки. Результаты анализа этого показателя приведены в табл. 3.

 

Таблица 3. Влияние препарата ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR на среднюю продолжительность жизни мышей линии BALB/с с трансплантированной CT26 EGFR, сутки, Me [Q₁–Q₃]

Table 3. The effects of ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR radiopreparation upon mean lifespan of BALB/с male mice with с трансплантированной CT26 EGFR, day, Me [Q₁–Q₃]

Обследуемые группа / Experimental groups			УПЖ, %/ LSI, %
Группа 1 / Group 1	Группа 2 / Group 2	Группа 3 / Group 3
28 [24–29]	34 [25–36]	38 [36–38]*	Группа 2 / Group 2 21 % Группа 3 / Group 3 36 %

Примечание. УПЖ — увеличение продолжительности жизни; клинически значимый уровень отличий, >25 %. *Отличие от показателей контрольной группы достоверны на принятом уровне значимости, p < 0,05. Note. LSI — lifespan increment, clinically valid level of difference, >25%. *Difference from control group values are valid, p < 0.05.

 

Наибольшее увеличение продолжительности жизни наблюдалось при курсовом применении тестируемого препарата, в среднем на 10 сут, по сравнению с группой мышей, не получавших лечение (р = 0,047). При этом был достигнут клинически значимый уровень. Продолжительность жизни мышей группы 2 (однократное применение тестируемого препарата) достоверно не отличалась ни от контрольных показателей, ни от значений, полученных в группе животных, получавших тестируемый препарат дважды (табл. 3).

ВЫВОДЫ

1. Терапевтический таргетный радиофармацевтический лекарственный препарат ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR обладал высокой фармакологической эффективностью в отношении оцениваемого новообразования — трансплантированной аденокарциномы толстой кишки мышей (клеточная линия — CT26 EGFR). Это проявлялось в значительном увеличении средней продолжительности жизни подопытных животных, ингибировании латентного периода развития опухоли и клинически значимом торможении ее роста.
2. Курсовое применение ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR в сравнительном плане было более эффективным по отношению к однократному введению подопытным животным.
3. Результаты исследования противоопухолевой активности ¹⁷⁷Lu-DOTA-anti-CTLA4-GITR указывают на необходимость проведения доклинических и перспективность последующих клинических исследований этого лекарственного препарата в онкологии.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Об авторах

Александр Петрович Трашков

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»; Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Автор, ответственный за переписку.
Email: alexander.trashkov@gmail.com

канд. мед. наук, заведующий, Центр доклинических и клинических исследований

Россия, Гатчина, Ленинградская обл.; Москва

Тамара Давидовна Гаглоева

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»; Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: gagloeva_td@pnpi.nrcki.ru

мл. научн. сотр., Центр доклинических и клинических исследований; мл. научн. сотр., Ресурсный центр нейрокогнитивных исследований

Россия, Гатчина, Ленинградская обл.; Москва

Александр Игоревич Будько

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Email: budko_ai@pnpi.nrcki.ru

лаборант-исследователь, Центр доклинических и клинических исследований

Россия, Гатчина, Ленинградская обл.

Андрей Николаевич Петровский

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Email: petrovskiy_an@pnpi.nrcki.ru

канд. мед. наук, доцент, ст. научн. сотр., Центр доклинических и клинических исследований

Россия, Гатчина, Ленинградская обл.

Олеся Иршатовна Тимаева

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: timaeva_oi@nrcki.ru

канд. хим. наук, ученый секретарь, Курчатовский комплекс НБИКС-природоподобных технологий

Россия, Москва

Николай Васильевич Цыган

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»; Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: tsygan_nv@pnpi.nrcki.ru

д-р мед. наук, доцент, вед. научн. сотр., Центр доклинических и клинических исследований; заместитель начальника, кафедра нервных болезней

Россия, Гатчина, Ленинградская обл.; Санкт-Петербург

Андрей Алексеевич Станжевский

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»; Российский научный центр радиологии и хирургических технологий им. акад. А.М. Гранова

Email: stanzhevsky_aa@pnpi.nrcki.ru

д-р мед. наук, профессор, ведущий научный сотрудник, Центр доклинических и клинических исследований; заместитель директора по научной работе

Россия, Гатчина, Ленинградская обл.; Санкт-Петербург

Андрей Глебович Васильев

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Email: avas7@mail.ru

д-р мед. наук, профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии с курсом иммунопатологии

Россия, Санкт-Петербург

Дмитрий Николаевич Майстренко

Российский научный центр радиологии и хирургических технологий им. акад. А.М. Гранова

Email: info@rrcrst.ru

д-р мед. наук, профессор, директор

Россия, Санкт-Петербург

Кристина Анатольевна Сергунова

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: sergunova_ka@nrcki.ru

канд. тех. наук, главный ученый секретарь

Россия, Москва

Дмитрий Сергеевич Сысоев

Российский научный центр радиологии и хирургических технологий им. акад. А.М. Гранова

Email: info@rrcrst.ru

канд. физ.-мат. наук, руководитель группы разработки и производства приборов для ядерной медицины

Россия, Санкт-Петербург

Сергей Васильевич Шатик

Российский научный центр радиологии и хирургических технологий им. акад. А.М. Гранова

Email: s_shatik@hotmail.com

канд. биол. наук, руководитель отделения циклотронных радиофармпрепаратов

Россия, Санкт-Петербург

Дмитрий Олегович Антуганов

Российский научный центр радиологии и хирургических технологий им. акад. А.М. Гранова

Email: info@rrcrst.ru

научный сотрудник, лаборатория радиофармацевтических технологий

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Леонидович Коневега

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»; Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: konevega_al@pnpi.nrcki.ru

канд. физ.-мат. наук, руководитель молекулярной и радиационной биофизики; начальник отдела биомедицинских технологий

Россия, Гатчина, Ленинградская обл.; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы