Neutron-Activative Analysis of Bone Tissue in Children with Rickets-Like Diseases

Full Text

Рахитоподобные заболевания (РПЗ) относятся к группе метаболических заболеваний опорно-двигательного аппарата, характеризующихся генерализованной остеомаляцией и деформацией костей скелета. Их этиология и патогенез сложны и малоизученны. Известно, что одной из причин деминерализации костной ткани является нарушение метаболизма витамина D на ренальном уровне и дефицит синтеза его активной формы — 1,25-(OH)₂D₃ [1]. Применение витамина D и его метаболитов в комплексе с препаратами кальция и фосфора позволяет добиться определенного лечебного эффекта, проявляющегося и в положительной динамике минерализации кости. Однако происходящее относительное увеличение минеральной компоненты еще не дает достаточных оснований говорить о полноценности процесса минерализации костной ткани. Более полное представление о нем можно получить, зная содержание и соотношение основных компонентов костного гидроксиапатита, а также некоторых остеотропных микроэлементов. Существуют многочисленные данные, из которых следует, что в состав полноценного костного гидроксиапатита входят, помимо кальция и фосфора, такие элементы, как магний и натрий. Известно также, что нарушения метаболизма многих микроэлементов в организме, обусловленные как экзогенными, так и эндогенными факторами, вызывают тяжелые органические и функциональные расстройства скелета, в том числе так называемый «стронциевый», «бериллиевый», «бариевый», «алюминиевый» и «марганцевый» рахит [1, 10, 27]. При этом нарушение нормального формирования скелета может быть связано как с избыточным, так и с недостаточным поступлением микроэлементов в организм.

Несмотря на обилие наблюдений, подтверждающих важную роль многих химических элементов в процессах минерализации скелета, мы не обнаружили в литературе данных об исследовании их содержания в костной ткани детей с РПЗ.

В настоящей работе представлены результаты определения содержания 20 химических элементов в биоптатах крыла подвздошной кости у детей контрольной группы и у детей с РПЗ до и после медикаментозного лечения.

Материал и методы исследования. Обследовано 20 детей с РПЗ: 16 с витамин D-резистентным рахитом (ВДРР), 1 с витамин D-зависимым рахитом (ВДЗР), 1 с почечным тубулярным ацидозом (ПТА), 1 с болезнью де То-ни—Дебре—Фанкони (ТДФ), 1 с остеомаляцией, вызванной генерализованным пигментированным бородавчатым невусом (ПБН). Контрольную группу составили 13 условноздоровых детей: с врожденным подвывихом головки бедра, солитарными кистами верхних конечностей, хондромой фаланг пальцев. Возраст обследованных — от 12 до 15 лет.

Медикаментозное лечение включало применение лекарств, действие которых направлено на коррекцию метаболических изменений: нарушений минерального обмена, метаболического ацидоза, витаминного дефицита и др. Адекватные безопасные дозы витамина D подбирались с учетом формы заболевания, возраста и массы тела ребенка. При ВДРР они составляли от 4000 до 7000 МЕ/(кг • сут), при ВДЗР — 300 МЕ/(кг • сут), при ПТА — 2000 МЕ/(кг • сут), при ТДФ — 4000 МЕ/ (кг • сут), при ПБН — 1000 МЕ/(кг • сут). Метаболические дозы витамина D (оксидевит или 1-α-холекальциферол) составляли 1,5-4 мкг/ сут. Дефицит Са и Р возмещали применением глюконата кальция (2-3 г/сут), фитина (1-2 г/сут), глицерофосфата кальция (2-3 г/сут). Проводилась терапия витаминами А, Е, В. Больной с ПБН дополнительно назначали кальцитрин (в течение месяца каждые полгода). Определение основных биологических и химических показателей крови и мочи в динамике позволяло устранять гипервитаминоз D и вовремя корректировать терапию.

Биопсию крыла подвздошной кости производили с помощью тонкостенного титанового трокара под местной анестезией. Биоптаты разделяли на две части титановым ножом, одну часть исследовали морфологически, другую часть массой от 20 до 50 мг — с помощью инструментального нейтронно-активационного анализа (ИНАА).

При проведении ИНАА биоптаты взвешивали, высушивали в замороженном виде, вновь взвешивали, упаковывали в полиэтиленовые ампулы и облучали в канале реактора с потоком нейтронов около 1,7 • 10¹³ нейтр./(см² • с). Время облучения — 3-5 мин в зависимости от массы биоптата. Через 1 мин после облучения проводили первое измерение гамма-спектра с энергией до 3,5 МэВ. Измеряли содержание Mg, P, Сl и Са, используя соответственно излучение радионуклидов ²⁷Mg, ²⁸Аl, ³⁸Сl и ⁴⁹Са. Через 1-1,5 ч после облучения проводили повторное измерение гамма-спектра продолжительностью 30 мин. При повторном измерении определяли содержание Na, К, Мn и Sr, используя соответственно излучение радионуклидов ²⁴Na, ⁴²К, ⁵⁶Мn и ^87mSr.

После анализа по короткоживущим радионуклидам биоптаты заворачивали в фольгу из особо чистого алюминия и помещали в кварцевую ампулу. Запаянную ампулу с биоптатами облучали в охлаждаемом вертикальном канале с потоком тепловых нейтронов около 1,2 • 10¹³ нейтр./(см² • с) в течение 100 ч. Через 60-90 сут после облучения биоптаты переупаковывали в чистую фольгу и проводили спектрометрические измерения по долгоживущим радионуклидам. Продолжительность каждого измерения составляла от 8 до 24 ч. Определяли содержание Sc, Cr, Fe, Со, Zn, Se, Rb, Ag, Sb, Cs, Tb и Hg, используя соответственно излучение радионуклидов ⁴⁶Sc, ⁵¹Cr, ⁵⁹Fe, ⁶⁰Co, ⁶⁵Zn, ⁷⁵Se, ⁸⁶Rb, ^110mAg, ¹²⁴Sb,¹³⁴Cs, ¹⁶⁰Tb и ²⁰³Hg, образовавшихся в биоптатах костной ткани под воздействием нейтронов по (n, γ) ядерным реакциям.

Использовали спектрометрическую систему NUC-8100 (Венгрия) с IBM PC АТ и Ge (Li)-детектором объемом 100 см³. Разрешение составляло около 4 КэВ на линии ⁶⁰Со 1333 КэВ. Концентрации элементов вычисляли с помощью относительного метода, сравнивая площади фотопиков радионуклидов, наведенных в биоптатах и эталонах под действием нейтронов. В качестве эталонов использовали смесь особо чистых веществ и синтетические стандарты на основе фенолформальдегидной смолы [37]. Правильность результатов контролировали параллельным анализом Международного стандартного материала сравнения IAEA — Н-5 (кость животных). Условия анализа приближались к оптимальным [6], при этом ошибка измерения для Са, P, Na, Cl, Zn, Fe и Со составляла не более 3-5%, для Se, Hg, Cr и Sb — 5-10%, для Mg, К, Rb и Tb — 10-20%, для Sc, Mn, Sr, Ag и Cs — 20-30%.

Результаты и обсуждение. Из табл. 1 видно, что найденные значения для основных элементов минеральной компоненты крыла подвздошной кости в контрольной группе детей вписываются в диапазоны концентраций, приводимые в литературе для костной ткани. Результаты для Са, Na, К и Cl очень хорошо согласуются с имеющимися данными о содержании этих элементов в крыле подвздошной кости взрослого человека [14, 17]. Хотя приводимое в работе Forbes и соавт. [17] значение для Р несколько выше полученного нами, хорошее согласование по всем остальным элементам позволяет заключить, что к 12-15 годам содержание основных химических элементов минеральной компоненты крыла подвздошной кости у здоровых детей практически не отличается от такового у взрослых. Вывод о сравнительно раннем формировании минеральной компоненты костной ткани подтверждают и данные Woodara и White [36], которые не обнаружили различий в содержании Са, P, Mg в кортикальной костной ткани у детей в возрасте от 6 до 13 лет и у взрослых 29-74 лет.

 

Таблица 1. Средние значения (M±SD) концентраций основных макроэлементов в крыле подвздошной кости (в мг на 1 г сырой ткани) в группе детей с РПЗ до и после медикаментозной терапии

 

Элемент	Пациенты с РПЗ (n=20)		Контрольная группа (n=13)	Данные литературы для взрослых
	до лечения	после лечения		костная ткань*	крыло подвздошной кости
Са	108±7 р<0,05	146±12	157±18	108-259	176 [17] 145±5 [14]
Р	34,4±2,7 (р<0,05)	42,8±2,6	48,2±4,3	50-144	77 [17]
Mg	0,78±0,07 р<0,01	0,98±0,07 р<0,05	1,43±0,19	0,7-05	—
Na	4,19±0,25	4,78±0,30	4,79±0,45	1,00-9,45	4,77 [17] 3,9±0,2 [14]
К	1,14±0,16	0,96±0,11	0,94±0,14	0,49-1,47	1,25 [17] 0,62±0,15 [14]
Cl	1,41±0,11	1,76±0,26	1,35±0,20	0,63-2,00	1,12 [17]

* Приведены диапазоны вариации средних значений концентраций, найденные из данных в работах [2, 4, 8, 13, 14, 19, 29, 36]
Примечание: р - достоверность различия с контрольной группой по критерию Стьюдента.

 

Принято считать, что в норме в костной ткани соотношение концентраций Са:Р и Ca:Mg равны соответственно 2 и 55 [8]. Первое соотношение может быть получено и из стехиометрического расчета в предположении, что в костной ткани оба эти элемента представлены только в виде гидроксиапатита. Однако, по нашим данным, в крыле подвздошной кости в норме соотношения этих элементов существенно отличаются от вышеприведенных и составляют соответственно 3,3 и 110. Следует отметить, что величина отношения Са:Р, близкая к 3, найдена и в других исследованиях, например для большеберцовой кости [22]. Это указывает на то, что в костной ткани, помимо гидроксиапатита, значительная часть кальция содержится и в других соединениях.

Хотя Na, как и Сl, является основным электролитом экстрацеллюлярного пространства, его в полной мере можно считать и одним из основных элементов минеральной матрицы, так как известно, что ионы Na диффундируют в гидратный слой кристаллов оксиапатита, а также внедряются в поверхность кристаллов, замещая другие ионы, например ионы Са [26]. Некоторые авторы вообще весь Na костной ткани связывают с его минеральной матрицей [14]. Однако поскольку отношение Na:Cl в экстрацеллюлярном пространстве близко к 1,25, то, пренебрегая сравнительно незначительным количеством внутриклеточного Na костной ткани, по данным табл. 1 можно определить, что на долю минеральной матрицы крыла подвздошной кости в норме приходится около 65% от общего содержания элемента. Эта величина близка к результатам оценки пула медленнообменного Na (т.е. связанного с минеральной матрицей) в большеберцовой кости человека — 60%, сделанной методом in vivo нейтронно-активационного анализа [15].

Полученные данные о микроэлементном составе крыла подвздошной кости в контрольной группе детей вписываются в диапазоны концентраций, приводимые в литературе для костной ткани (табл. 2). Однако эти диапазоны настолько широки, что отношения между максимальными и минимальными средними значениями для некоторых микроэлементов составляют более 10³-10⁴. Такие перепады, вероятно, связаны не столько с возможной специфичностью микроэлементного состава различных костей скелета или значительной индивидуальной вариабельностью, сколько с трудностями анализа костной ткани и, как следствие, с большими аналитическими погрешностями. В доступной нам литературе мы обнаружили лишь одну работу, в которой приведены результаты исследования микроэлементов в аутопсийном материале крыла подвздошной кости взрослого здорового человека [14]. Из 14 исследованных нами микроэлементов в этой работе приведены данные для 11. Сравнительно хорошо сходятся результаты для Zn, Sr и Se, тогда как содержание остальных 8 микроэлементов в крыле подвздошной кости взрослого человека в среднем в 5-100 раз превышает полученные нами данные для детей (см. табл. 2). Хотя известно, что с возрастом многие остеотропные элементы накапливаются в костной ткани, столь существенные различия вряд ли можно объяснить только этим.

 

Таблица 2. Средние значения (M±SD) концентраций основных микроэлементов в сухой ткани крыла подвздошной кости для детей (контрольная группа) и взрослых

Элемент	Дети контрольной группы (п=13)	Данные литературы для взрослых
		костная ткань*	крыло подвздошной кости [14]
Sc, нг/г	2,3±0,5	1,0-4600	80±10
Сг, мкг/г	0,70±0,21	0,1-33	15,±5,8
Mn, мкг/г	0,82+0,08	0,03-116	104±26
Fe, мкг/г	90±11	0,22-2040	598±80
Со, нг/г	5,2±0,6	10-43500	350±100
Zn, мкг/г	105±5	42,5-221	159,9±7,2
Se, мкг/г	0,22+0,03	0,02-8,95	0,47±0,08
Rb, мкг/г	1,87±0,37	0,1-5,11	—
Sr, мкг/г	140±11	42,6-270	162,2±8,1
Ag, рг/г	44+8	3-6000	—
Sb, рг/г	64±15	7-810	250±40
Cs, рг/г	4,4±0,6	10-98	—
Tb, нг/г	8,7±1,2	—	48±9
Hg, нг/г	7,9±1,4	20-4700	780±110

* Приведены диапазоны вариации средних значений концентраций, найденные из данных в работах [2, 5, 7-9, 11, 13, 16, 19, 20, 21, 23, 29-32, 36].

 

У детей с РПЗ по сравнению с контрольной группой в крыле подвздошной кости статистически достоверно снижено в среднем на 30% содержание Са и Р, а также более чем на 45% содержание Mg (см. табл. 1). Абсолютные значения и соотношение внутриклеточного объема (К) и экстрацеллюлярного пространства (Сl) в крыле подвздошной кости у детей с РПЗ соответствуют нормальным уровням, а содержание Na, связанного с минеральной матрицей, по расчетам составляет лишь 45%, т.е. меньше нормы примерно на 31%. Помимо отличия абсолютных значений содержания основных компонентов минеральной матрицы, при РПЗ наблюдаются и статистически достоверные сдвиги в соотношениях концентраций таких элементов, как Ca:Mg (р<0,05), Ca:Na (р<0,05), P:Na (р<0,05) и Mg:Na (р<0,01).

В норме в крыле подвздошной кости статистические достоверные корреляционные зависимости имеются между концентрациями Са и Р (r = 0,80), а также Са и Mg (r = 0,96), т.е. между химическими элементами, представляющими минеральную компоненту. При РПЗ в результате недостаточной минерализации костной ткани отчетливо проявляются также и корреляционные зависимости между концентрациями элементов, в большей степени отражающими состояние органического матрикса: Na-Cl, Na-K и К-Сl.

При РПЗ содержание многих микроэлементов в крыле подвздошной кости выше возрастной нормы (табл. 3). Такой вывод можно сделать на основании данных для группы детей с ВДРР, где с высоким уровнем статистической достоверности содержание Zn, Sr и Mg больше нормы соответственно на 32% (р<0,002), 63% (р<0,02) и 71% (р<0,02). Этот феномен может иметь следующее объяснение. Хотя патогенез ВДРР сложен и недостаточно изучен, принято считать, что одной из главных причин заболевания является врожденный дефект превращения 25-OHD₃ в гормональноактивную форму вследствие рецессивно наследуемой недостаточности 25-гидроксивитамин О₃-1-α-гидроксилазы в почках [1]. Поскольку действие витамина D осуществляется путем образования в энтероцитах специальных транспортных систем с участием активных механизмов, таких как Са-связывающий белок, Са²⁺-АТФаза или Na-P-котранспортная система, недостаток его активной формы приводит к нарушению всасывания в кишечнике Са и Р. Относительно влияния витамина D на всасывание других элементов данных весьма мало, и пока нет оснований считать, что витамин D специфическим образом обеспечивает в кишечнике транспорт какого-либо еще элемента [1].

 

Таблица 3. Содержание микроэлементов в сухой ткани крыла подвздошной кости у детей с РПЗ до и после медикаментозной терапии

Микро­элемент	ТДФ (n=1)	ПТА (n=1)	ПБН (n=1)	ВДЗР (n=1)	ВДРР (n=16)
					до лечения		после лечения
					M±SD	Р	M±SD	Р
Sc, мг/г	5,4	3,4	66	10	6,3±2,0		2,6±0,4
Cr, мкг/г	2,75	0,25	55	1,17	1,99±1,36		0,79±0,23
Mn, мкг/г	0670	2,18	7,59	0,92	1,40±0,21	<0,02 (+)	1,18±0,11	<0,02 (+)
Fe, мкг/г	173	54	815	170	112±12		78±14
Со, нг/г	8,3	3,6	260	2,7	11,0±4,5		11,8±3,6
Zn, мкг/г	103	177	179	115	139±8	<0,002 (+)	127±8	<0,02 (+)
Se, мкг/г	0,27	0,1	0,62	0,38	0,23±0,03		0,24±0,02
Rb, мкг/г	2,09	1,48	2,23	3	1,75±0,22		1,23±0,016
Sr, мкг/г	122	269	359	144	228±35	<0,02 (+)	209±24	<0,02 (+)
Ag, нг/г	39	44	6020	53	44±10		66±18
Sb, нг/г	48	76	3960	51	91±36		69±7
Cs, нг/г	3,5	5,9	54	2,6	5,1±0,5		2,8±0,2	<0,05 (-)
Tb, нг/г	2,8	10	53	4,1	11,9±1,4		10,7±1,1
Hg, нг/г	1,1	4,5	33	3,5	11,9±2,3		8,2±1,4

Обозначения: (+) — выше нормального уровня, (-) — ниже нормального уровня; р — достоверность различия с нормой.
Примечание. Для детей с ТДФ, ПТА, ПБН, ВДЗР из-за единичности наблюдений приведены только показатели до лечения.

 

Таким образом, резистентность Sr, а тем более Мn и Zn к витамину D приводит при дефиците его активной формы к нарушению парциальных концентраций, т.е. к повышению их содержания во внутренней среде организма относительно содержания Са и Р. При этом важно отметить, что в сыворотке крови только 50% Са находится в диализуемой форме, в то время как Sr, Мn и Zn — более 80% [18]. Обусловленная этим повышенная физиологическая активность ионов Sr, Мn и Zn в крови может оказывать как прямое, так и опосредованное отрицательное влияние на процесс кальцификации костной ткани путем изменения метаболизма витамина D в организме. Так, при отсутствии должной конкуренции со стороны Са в зоне минерализации могут накапливаться избыточные количества щелочноземельных и переходных металлов, которые тормозят обызвествление органической основы, вероятно, через угнетающее действие на процессы окислительного фосфорилирования [10, 33, 34]. Zn также угнетает активность железосодержащих ферментов — цитохромоксидазы и каталазы, которые, как известно, играют важную роль в повышении способности остеобластов к синтезу коллагена [10, 14]. Помимо этого, несбалансированная активность ионов Sr, Мn и Zn в крови может являться дополнительной причиной подавления в почках реакции гидроксилирования 25-OHD₃ и его трансформации в 1,25-(OH)₂D₃ [25, 28], а также уменьшения скорости секреции гормона паратиреоидных желез [24, 35], усугубляя тем самым врожденный дефект у больных с ВДРР.

Интересно отметить, что если в наблюдавшихся единичных случаях ТДФ, ПТА и ВДЗР сдвиги в микроэлементном составе костной ткани были близки к таковым у детей с ВДРР, то у больной с ПБН содержание таких микроэлементов, как Cr, Sb, Ag, Cs, Sc, Fe, Со и Mn, превышало норму более чем в 10-100 раз (см. табл. 3).

Применение больших доз витамина D и его метаболитов в комплексе с препаратами кальция и фосфора у больных с РПЗ позволило добиться положительного эффекта, проявлявшегося в увеличении темпов роста больных, устранении болевого синдрома, стабилизации фосфорно-кальциевого гомеостаза [12], а также повышении минерализации костной ткани (см. табл. 2). Так, медикаментозное лечение приводило у большинства детей с РПЗ к нормализации содержания всех основных химических элементов минеральной компоненты кости, за исключением Mg, дефицит которого сохранялся, проявляясь как в абсолютном значении концентрации элемента, так и в соотношении концентраций Ca:Mg (до лечения — 150±15, через год после начала лечения — 150±7 при возрастной норме 110±4). В то же время увеличение содержания Mg в костной ткани под действием лечения метаболитами витамина D без дополнительного восполнения его дефицита с помощью лекарственных веществ позволяет предположить участие 1-α-OHD₃ через образование 1,25-(ОН)₂D₃ в транспортировке этого элемента в кишечнике. Учитывая важную роль Mg в процессах минерализации костной ткани, можно сделать вывод о необходимости включения в комплексную программу лечения детей с РПЗ препаратов, содержащих Mg. Экспериментальные исследования подтверждают преимущество такого лечения [3].

Через год после начала лечения средние концентрации Sr, Мn и Zn в крыле подвздошной кости у детей с РПЗ, несмотря на наметившуюся тенденцию к уменьшению, оставались выше нормы (см. табл. 3, группа ВДРР). Сохраняющийся дефицит Mg и избыток некоторых микроэлементов позволяют предполагать определенную неполноценность костной ткани и указывают на необходимость дальнейшего лечения. С нашей точки зрения, пролонгированное применение витамина D, способствующее ускоренному обновлению костной ткани, а также препаратов кальция и фосфора, а возможно, и магния, нормализующих парциальные концентрации макро- и микроэлементов во внутренней среде организма, со временем может привести к формированию у детей с РПЗ полноценного по составу химических элементов скелета. У взрослых за год новой костной тканью замещается не более 10% общей массы скелета. В детском возрасте и при применении больших доз витамина D процесс обновления протекает быстрее, и поэтому можно полагать, что лечение должно продолжаться на протяжении нескольких лет, разумеется, с учетом индивидуальных особенностей организма и под контролем не только основных минеральных компонентов, но и микроэлементов костной ткани.

About the authors

V. E. Zaichik

Medical Radiological Research Centre; Priorov Central Institute of Traumatology and Orthopaedics

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Obninsk; Moscow

A. P. Berezhniy

Medical Radiological Research Centre; Priorov Central Institute of Traumatology and Orthopaedics

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Obninsk; Moscow

A. I. Snetkov

Medical Radiological Research Centre; Priorov Central Institute of Traumatology and Orthopaedics

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Obninsk; Moscow

References

Supplementary files