Radiation sterilization of demineralized bone grafts in the light of hepatitis B and C infection prevention

Full Text

С открытием в последнее время ряда ранее не диагностируемых вирусных инфекций, способных передаваться через костные имплантаты, обеспечение безопасности использования данного материала в пластической хирургии стало одной из главных проблем биоимплантологии. Объем хирургических вмешательств с использованием биологических тканей возрастает с каждым годом. Есть определенные успехи в создании и клиническом применении синтетических материалов и биологических тканей, взятых от животных (ксенотрансплантаты). Безусловно, перспективными и многообещающими являются технологии с привлечением генной инженерии, методики клонирования органов и тканей. Каждое направление несет в себе ряд проблем — морально-этических, технологических, иммунологических и др. При создании искусственных материалов проблема исключения опасности инфицирования реципиента через имплантаты решается достаточно эффективно. Сложнее обстоит дело при использовании донорских тканей, в которых могут присутствовать возбудители бактериальной, грибковой и особенно вирусной инфекции [12, 15, 17, 18]. Вместе с тем на сегодняшний день наиболее подходящими имплантатами в травматологии и ортопедии являются именно биологические ткани человеческого происхождения (аллотрансплантаты). В частности, к ним относятся деминерализованные костные трансплантаты (ДКТ), обладающие остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами.

Процесс стерилизации ДКТ — обязательный и чрезвычайно важный этап их изготовления. Лабораторные исследования плазмы крови доноров на наличие антител к вирусу гепатита С (HCV) и антигенов вируса гепатита В (HBV) полностью не гарантируют от ошибок в диагностике вирусных гепатитов. Реальностью остается тот факт, что в настоящее время ложноотрицательные результаты исследований на носительство вирусов гепатитов встречаются при использовании самых чувствительных диагностических методик. Вероятнее всего, это связано с множеством сопутствующих факторов — состоянием иммунитета донора, сроками от начала заболевания и т.д. Как бы то ни было, имеется ряд зафиксированных случаев инфицирования пациентов HIV (ВИЧ), гепатитами HCV и HBV после имплантации им костных и других биологических материалов [8].

Воздействие на донорский инфицированный материал охлаждением (до -80°С) или нагреванием (до +65°С) не устраняет опасности передачи вирусов реципиенту [7~13, 19, 20]. Стерилизация оксидом этилена также не гарантирует от возможности инфицирования больных [8]. К тому же остаются спорными вопросы о токсических свойствах оксида этилена и его влиянии на остеоиндуктивную способность ДКТ [9, 14].

Оптимальным методом стерилизации, на наш взгляд, является радиационный (сравнительные* характеристики двух видов лучевого воздействия — у-лучами и потоком быстрых электронов   в

настоящей статье не рассматриваются). Мы использовали облучение образцов потоком ускоренных электронов для определения минимальной дозы лучевой стерилизации, при которой происходит разрушение маркеров гепатита В (HBsAg) и гепатита С (РНК) в ДКТ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом изучения являлись образцы, изготовленные из большеберцовых костей человека, размером 2x2 см. Образцы были разделены на две серии (по 24 в каждой): первая — ткани от доноров, инфицированных HBV, вторая — HCV. Диагноз ставился после исследований плазмы крови в аппарате B4312L (Bio-Kinetics Reader) с использованием тест-систем (Rekombi-BEST anti-VGS-Strip и Vectogen B-HBs-antigen-Strip). Доноры выбирались произвольно, степень «загрязненности» материала не определялась.

Инфицированные фрагменты костной ткани проходили все этапы технологии изготовления ДКТ по методике ЦИТО [1]: механическую очистку кости от мягких тканей, обработку 3% раствором перекиси водорода и ультразвуком для удаления элементов крови и жирового компонента соответственно; деминерализацию в 0,6 н. HCI в течение 24 ч; удаление из образцов хлористоводородной кислоты с использованием раствора тиосульфата натрия; помещение деминерализованных образцов в холодильную установку при — 35°С (до 10 сут); лиофилизацию в течение 48 ч в установке LZ 9.2; упаковку в стандартные пластиковые пакеты медицинского назначения.

Каждая серия образцов была разделена на 6 групп в соответствии с используемой дозой облучения потоком быстрых электронов — 15, 22, 29, 36, 43 и 50 кГр. Стерилизация проводилась при помощи радиационно-технологических установок ЛУЭ-8-5М и УООЗ МВ с энергией излучения 8-9 Мэ-В, мощностью дозы 1,0 кГр/c. Погрешность измерения поглощенной дозы излучения составляла 10%.

Сохранение (отсутствие) HBsAg в образцах устанавливали при помощи иммуноферментного теста. Иммуноферментный тест по выявлению HBsAg проводили в соответствии с инструкцией по применению тест-системы Hepanostika HBsAg Uni-Form II фирмы «Organon». Полная инактивация HBsAg предполагалась тогда, когда отношение результатов замера в опытной лунке к результатам отрицательного контроля было равно или ниже 2,1.

Выделение РНК HCV из исследуемых образцов проводили стандартным методом с применением смеси гуанидин-тиоционат-фенол-хлороформ [3]. Детекцию РНК HCV выполняли по «пез1еб»-варианту RT-PCR с использованием праймеров на 5'-нетранслируемый регион [16]. Продукты амплификации анализировали путем электрофореза в 2% агарозном геле и окрашивали бромидом этидия. Результаты иммуноферментного анализа регистрировали спектрофотометрически.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты (см. таблицу) свидетельствуют о том, что для создания высокого уровня безопасности при использовании ДКТ необходима, невидимому, минимальная стерилизующая доза около 50 кГр. Достаточной для инактивации антигенов HCV в том же материале является доза 36 кГр. Современные нормативы лучевой стерилизации биологических тканей в странах, входящих в Европейскую ассоциацию тканевых банков, колеблются в диапазоне от 15 до 35 кГр [2, 5, 6]. При этом отмечаются существенные изменения в сторону уменьшения как прочностных характеристик пластического материала, так и его остеоиндуктивных свойств по мере увеличения поглощенной дозы ионизирующего излучения [6, 10].

 

Результаты определения маркеров гепатита В и С в образцах, облученных разными дозами потока быстрых электронов

Поглощенная доза, кГр	HBV (HBsAg)		HCV (РНК)
15+1,5	+ •		+
22±2,3	+		+
29±2,9	+		+
36±3,6	+
43±4,3	+
50±5,0	—

 

Наши данные не согласуются с результатами исследований Currey и соавт. [4], согласно которым доза лучевой стерилизации, необходимая для вирусной инактивации, приближается к 96 кГр. По нашим данным, радиационная нагрузка на пластический материал в 50 кГр позволяет сочетать высокую степень безопасности имплантатов с относительной сохранностью их остеоиндуктивных свойств. Резкое снижение этих свойств происходит при воздействии на костную ткань ионизирующего излучения в дозе от 50 кГр и выше [6]. Это подтверждается результатами нашего предварительного гистологического исследования образцов, свидетельствующими о значительном повреждении коллагена в имплантатах (см. рисунок).

 

Состояние клеточных элементов кортикальной кости после стерилизации потоком быстрых электронов. Электронная микроскопия, ув. 62 000.А — поглощенная доза 25 кГр: ядро клетки плотное, структурированное (а). Межуточное вещество плотное, коллагеновые волокна сохранены (б). Мембрана остеоцита хорошо выражена, без разрывов (в). В цитоплазме видны единичные вакуоли (г);Б — поглощенная доза 50 кГр: остеоцит разрушен, с сохранной клеточной мембраной (а). Ядро пикнотичное (б), хроматин агрегирован (в). Эндоплазматическая сеть сильно разрушена, с многочисленными пустотами и вакуолями (г).

 

Необходимость проведения исследований по оптимизации условий лучевой стерилизации биологических тканей очевидна. Открытие возбудителей HCV и других вирусных инфекций, в частности вируса Якоба—Крейнцфельда, передающихся через биологические объекты, ставит под сомнение безопасность применения аллои ксенотрансплантатов без проведения дополнительных диагностических тестов. К сожалению, ошибки, связанные с имплантацией инфицированного материала, допущенные за десятилетия существования биоимплантологии исключительно из-за недостаточного уровня знаний, спекулятивно используются против развития этой важнейшей области медицины.

Заключение. Резкое снижение количества и качества донорского материала заставляет уточнять нормы лучевой стерилизации, ставя во главу угла безопасность использования биологического пластического материала и частично жертвуя его свойствами. Установление минимальных доз лучевой стерилизации для инактивации антигенных структур вирусов гепатитов В и С в костных имплантатах на сегодняшний день не является сигналом к использованию ДКТ из инфицированного донорского материала. Однако при определенных условиях в случае необходимости массового изготовления костных трансплантатов воздействие потоком быстрых электронов в дозах, полученных нами в эксперименте, может стать дополнительным фактором безопасности. При этом, вероятнее всего, пострадают пластические свойства ДКТ. Поэтому необходимо дальнейшее изучение условий защиты биомеханических и остеоиндуктивных свойств ДКТ, подвергающихся стерилизации потоком быстрых электронов с дозой поглощения в пределах 50 кГр.

About the authors

M. V. Lekishvili

Central Institute of Traumatology and Orthopedics. N.N. Priorov

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow

E. I. Isaev

Institute of Virology. DI. Ivanovsky

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow

V. I. Ponomarev

Institute of Biophysics

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow

M. G. Vasiliev

Central Institute of Traumatology and Orthopedics. N.N. Priorov

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files