VOZMOZhNOST' PRIMENENIYa GENOMNOGO REDAKTIROVANIYa V LEChENII NEYRODEGENERATIVNYKh ZABOLEVANIY

Abstract

Full Text

Нейродегенеративные заболевания (НЗД) остаются одной из ключевых проблем современной неврологии. Болезнь Альцгеймера (БА) - основная форма первичной деменции в современном обществе, характери- зующаяся преимущественно прогрессирующей гибелью нервных клеток гиппокампа и коры больших полушарий. Гистологическое исследование мозга выявляет отложения бета-амилоидного белка в виде сенильных бляшек и агре- гаты фосфорилированной формы тау-белка в составе нейрофибриллярных клубков. Моногенные формы БА связаны с мутациями генов АРР, PSEN1 и PSEN2, а наиболее значимый фактор генетической предрасположенности при спо- радических случаях - е4-аллель гена АРОЕ (19q13.2) [4]. Болезнь Паркинсона (БП) занимает второе место по частоте встречаемости среди НЗД и характеризуется синдромом паркинсонизма в сочетании с рядом немоторных симпто- мов. основные клинические проявления БП связаны с поражением дофаминергических нейронов чёрной субстанции ствола мозга. Менделевское наследование встречается в 5-10% случаев БП, причем среди 20 генов данного заболева- ния основное значение имеют гены SCNA (альфа-синуклеин), PARK2 (паркин), LRRK2 (дардарин), PINK1, VPS35, GBA (глюкоцереброзидаза) [3]. К тяжелым и социально значимым формам НЗД относятся также боковой амиотрофичес- кий склероз (БАС), при котором наиболее часто встречаются мутации в генах SOD1 (Cu/Zn-супероксиддисмутаза) и C9orf72 [1], болезнь Гентингтона (БГ) с типичной «полиглутаминовой» мутацией в гене HTT [4] и др. БА, БП, БАС и другие НЗД характеризуются присутствием накопление аномальных агрегированных белков: внеклеточные бета-амилоидные бляшки и внутриклеточные тау-клубки при БА, альфа-синуклеиновые тельца и нейриты Леви при БП, агрегаты SOD-1 или TDP-43 при БАС [11, 19]. Предполагается, что хроническая продукция патологичного белка может быть причиной прогрессирующей гибели нейронов, опосредованной об- щими молекулярными механизмами и метаболическими путями [22]. Перспективными молекулярными методами лечения больных c НЗД, считаются коррекция экспрессии патологичексого гена, иммунотерапия против аномальных белков цНС, клеточная регенеративная терапия и сочетание генной инженерии с клеточной терапией - трансплантация генетически модифицированных стволовых клеток. Широко изучается также явление РНК-интерференции: исследователь может инъецировать двуцепочечные фрагменты РНК, комплепментарные участку мРНК таргетного гена, что приведет к расщеплению образовавшегося гибрида и предотвратит трансляцию мутантного гена. Моделирование нейродегенеративных болезней с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Исследование культур нейронов, получаемых путем направленной дифференцировки из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), позволяет оценить взаимосвязь между дегенеративными изменения- ми и характером клинического синдрома. такие культуры могут служить уникальной моделью для тестирования различных соединений на нейропротекторную активность и использоваться для мониторинга нейродегенератив- ных изменений на фоне терапевтических вмешательств [5]. Исследования механизмов репрограммирования и дифференцировки клеток человека имеют большое значение как для фундаментальной науки, так и (в перспекти- ве) для развития клеточной терапии. Лечение НДЗ, патогенез которых обусловлен мутациями конкретных генов, требует вмешательства в организм больного на генном уровне. В настоящее время для коррекции экспрессии гена-мишени существует ряд подходов, некоторые из которых остаются экспериментальными, тогда как другие уже проходят клинические ис- следования. Растущую роль в современной нейробиологии играют новые высокотехнологичные подходы к мо- делированию НЗД. Среди них - направленное геномное редактирование с помощью искусственных нуклеазных систем, позволяющее осуществлять коррекцию генетических дефектов на уровне клеток. Перспективным пред- ставляется применение технологии геномного редактирования на специализированных нейронах и ИПСК, полу- чаемых от больных с наследственными формами НЗД в результате клеточного репрограммирования [23]. ИПСК, полученные из зрелых соматических клеток, представляют собой уникальную платформу для изучения генов, вовлеченных в молекулярные механизмы возникновения аномальных фенотипов, моделирования заболеваний на тканях, изучения действия лекарственных препаратов. Редактирование генома с помощью нуклеаз «цинковых пальцев». Первым инструментом для коррекции генома стала эндонуклеаза «цинковые пальцы» (ZNF - особые химически активные домены белка), представляю- щая собой белковый комплекс из разрезающего ДНК фермента и ДНК-связывающего домена. Когда две нуклеазы соединяются со своими мишенями, находящимися на расстоянии 5-7 п.о. друг от друга в правильной ориентации, нуклеазный домен димеризуется и вносит двухнитевый разрыв в ДНК в интересующем локусе, после чего осу- ществляется гомологическая репарация или негомологическое соединение концов ДНК [16]. Использование данного подхода позволило внести мутации A53T (G209A) и E46K (G188A) в ген SNCA эмбриональных культур человеческих клеток для воссоздания модели БП, обусловленной данными мутациями. Экспрессия мутантного альфа-синуклеина в нейронах, полученных из модифицированных стволовых клеток, была сравнима с таковой в нейронах, полученных в результате дифференцировки пациент-специфических ИПСК от больного с БП с данной мутацией [21]. одновременно была проведена коррекция мутации с помощью ZNF в ИПКС, полученных из фибробластов пациента с БП: показано отсутствие мутантного белка в дофаминергичес- ких нейронах, полученных в результате дифференцировки корректированных ИПКС [21]. Система ZNF позволяет также регулировать экспрессию генов путем создания химерных конструкций; так, химерный белок ZNF-KRAB использовался для подавления экспрессии гена HTT в мозге мышей линии R6/2, служащих моделью БГ [14]. технология ZNF стала первым программируемым инструментом для коррекции генома, однако она под- разумевает использование белков, которые сложно модифицировать для применения с новыми генами-мишенями и сложно доставлять компоненты данной системы в клетки. Редактирование генома с помощью системы TALEN. В сиcтеме TALEN (Transcription Activator Like Ef- fector Nucleases) роль ДНК-распознающих структур играют белковые домены, каждый из которых «узнает» толь- ко один нуклеотид [8]. Соединяя ДНК-узнающий фрагмент с ферментом, расщепляющим ДНК, можно получить систему с высокой специфичностью действия. Примером использования системы TALEN для создания модели БП стало внесение в геном рыбы зебры мутантного гена GBA [13]. В другой работе в культуре стволовых клеток, полученных из фибробластов пациента с БГ, в первом экзоне с помощью системы TALEN была скорректированна экспансия CAG-повторов, причем коррек- ция сохранилась при дифференцировке ИПСК в специализированные нейроны in vitro и in vivo; это сопровожда- лось нормализацией ряда сигнальных путей передачи сигнала (BDNF и др.), повышением устойчивости клеток и нормализацией работа митохондрий в нейрональных предшественниках [7]. При полногеномном секвенировании 1795 пожилых жителей Исландии в гене белка-предшественника бета-амилоида (APP) была обнаружена мутация (A673T), которая защищает от БА и когнитивного снижения в пожилом возрасте [12]. С помощью системы TALEN в культуры стволовых клеток вводили мутацию A673V в ген APP, что способствовало развитию альцгеймеровской патологии за счет повышения агрегации и токсичности белка, тогда как введение мутации A673T сопровождалось снижением расщепления белка APP, что может служить защитой от развития БА [12]. Несмотря на относительную легкость и дешевизну синтеза по сравнению с комплексами «цинковые пальцы», белки TALENs достаточно сложно синтезировать и доставлять внутрь клеток. также проблемой являет- ся возможность непреднамеренных разрезов ДНК. Редактирование генома с помощью CRISPR/CAS 9. Благодаря своей простоте, эффективности и широким возможностям система CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Shot Palindromic Repeats) за короткое время нашла применение в самых различных областях фундаментальной и прикладной биологии, биотехнологии и ме- дицины. С помощью системы CRISPR/Cas9 можно осуществлять все виды модификаций генома: вносить точковые мутации, встраивать в определенные места новые гены либо, наоборот, удалять крупные участки нуклеотидных последовательностей, исправлять или заменять отдельные генетические элементы и фрагменты генов [2]. так, например, с помощью системы CRISPR/Cas9 и одноцепочечного донора удалось отредактировать гетерозиготную мутацию в 4-м экзоне гена PSEN1 в ИПСК, полученных из фибробластов пациентки с БА. Скор- ректированная клеточная линия в сопоставлении с мутантной линией является очень полезным ресурсом для изучения патологических клеточных фенотипов, связанных с этой конкретной мутацией [17]. Использую систему CRISPR/Cas9, исследователям удалось на карликовых свиньях выключить одновременно три гена, ассоциирован- ных с БП - DJ-1, PARK2 и PINK1 [Wang et al., 2016]. В результате полногеномного секвенирования не было выявле- но нецелевых замен и мутаций в геноме эмбрионов. таким образом, простота, эффективность и мощность системы CRISPR/Cas9 позволяют модифицировать от одного до нескольких генов у модельных животных, что предостав- ляет в руки исследователей поистине уникальные экспериментальные возможности в моделировании и изучении нейродегенеративных заболеваний [Wang et.al., 2016]. Плюрипотентные стволовые клетки человека, включая эмбриональные клетки и ИПСК, являются важ- нейшим инструментом регенеративной медицины. После трансплантации в мозг модельных животных диффе- ренцированные из стволовых клеток нейрональные предшественники выживают, созревают и способствуют поведенческому восстановлению в моделях БП [5], БГ [15], эпилепсии [10]. Эти результаты подчеркивают потенци- ал ИПСК в лечении НЗД. однако трансплантированные клетки не всегда интегрируются в правильные нейронные контуры и могут не вполне адекватно компенсировать утраченную функцию, что иногда чревато развитием серь- езных побочных эффектов (таких, например, как тяжелые дискинезии при трансплантации дофаминергических нейронов). одним из решений является разработка функционального «переключателя» в трансплантированных клетках, так что высвобождение нейротрансмиттера в них можно строго контролировать. Хемогенетические инс- трументы, в том числе DREADD (дизайнерский рецептор, активируемый исключительно дизайнерским препара- том), позволяют эффективно регулировать клеточную функцию [20]. DREADD - это семейство рекомбинантных G-протеиновых рецепторов, которые могут точно контролировать определенные сигнальные пути. Эти рецепторы могут активироваться фармакологически инертными соединениями, такими как клозапин-N-оксид (CNO), но не их нативным лигандом ацетилхолином. CNO можно принимать перорально, он легко проникает через гематоэн- цефалический барьер, что позволяет дистанционно управлять экспрессирующими DREADD-нейронами в мозге [6]. Чен и соавторы пересадили человеческие дофаминергические нейроны, полученные из ИПСК, в мозг мыши с моделью БП, при этом рецептор DREADD в ИПСК был активирован с применением системы CRISPR/CAS9. Было обнаружено, что активность человеческих дофаминергических нейронов точно регулируется in vitro и in vivo, включая передачу сигналов между имплантированными нейронами и стриатными нейронами хозяина [9]. ос- новной проблемой при геномном редактировании является доставка систем редактирования в ядро и вероятность появления потенциально опасных непреднамеренных разрезов ДНК. Заключение. Модели НДЗ на основе ИПКС, помимо их применения для поиска новых лекарств, поз- воляют преодолевать трудности в изучении механизмов развития этихзаболеваний, которые отчасти связаны с ограниченным доступом к человеческим нервным клеткам. Растущую роль в современной нейробиологии играют новые высокотехнологичные подходы к моделированию нейродегенеративных заболеваний человека. Среди них - направленное геномное редактирование с помощью искусственных нуклеазных систем (CRISPR/Cas9 и др.), позволяющее осуществлять коррекцию генетических дефектов на уровне клеток. особенно перспективным пред- ставляется применение технологии геномного редактирования на специализированных нейронах и ИПСК, полу- чаемых от больных с наследственными формами нейродегенерации в результате клеточного репрограммирования [23]. Геномное редактирование позволяет быстрое и высокоэффективное создание нокаутных линий ИПКС для работ, связанных с изучением функций генов, а также с внесением мутаций в геном ИПКС для точного воспроиз- ведения условий изучаемой болезни и возможной коррекции дефекта гена. В целом, технология редактирования генома пока достаточно медленно находит применение в клинике, но ее большое будущее несомненно. Благодарность. Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований