Email this article The effect of recombinant flagellin on the hematopoietic system in rats with acute radiation damage
- Authors: Sapozhnikov R.Y.1, Khalimov Y.S.1, Legeza V.I.1, Litvinenko R.I.1, Drachev I.S.2, Kraev S.Y.2, Simbirtsev A.S.3
-
Affiliations:
- Kirov Military medical academy
- State scientific-research test Institute of military medicine of Defense Ministry of the Russian Federation
- State Research Institute of Highly Pure Biopreparations
- Issue: Vol 21, No 4 (2019)
- Pages: 112-115
- Section: Articles
- URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/20687
- DOI: https://doi.org/10.17816/brmma20687
- ID: 20687
Cite item
Full Text
Abstract
In an experiment on irradiated rats, the effect of prophylactic and therapeutic administration of recombinant flagellin on the course and outcomes of acute radiation damage, as well as peripheral blood parameters, was studied in dynamics. It has been established that the anti-radiation activity of recombinant flagellin is most effective when prophylactically administered 15-30 minutes before irradiation. Thus, when rats were irradiated at a dose of 6 Gy, the survival rate of animals in the control group by the 30th day was 50±14%, and the average life expectancy was 23±3 days. In the case of prophylactic administration of recombinant flagellin at a dose of 100 μg/kg, the survival of irradiated rats increased by 33%, and the average life expectancy by 5 days was 83±11 and 28±2 days, respectively. The introduction of recombinant flagellin in dosages of 1 and 10 μg/kg was not very effective. With the introduction of recombinant flagellin after irradiation, the radioprotective effect of the drug could not be detected. To elucidate the mechanisms of action of recombinant flagellin, its effect on the peripheral blood indices of irradiated animals was studied. In animals of the control group irradiated at a dose of 6 Gy, pronounced leukopenia was observed in the peripheral blood. By 3 days after irradiation, a decrease in the level of leukocytes to 5,1×109/L was noted. As the hematological syndrome of acute radiation damage developed, leukopenia progressed and by 9 days the leukocyte level was 3,2×109/L. On the 14th day, a gradual recovery of the leukocyte pool was noted, in which an increase of almost 2 times was noted compared with 9 days, which amounted to 7×109/L. The recovery of leukocyte levels to reference values was recorded by 25 days, when their level was 31×109/L. All this suggests that the introduction of recombinant flagellin before irradiation at a dose of 100 μg / kg has a protective effect on hematopoietic and bone marrow cells of irradiated rats at a dose of 6 Gy. The results confirm the literature on the prospects of further research aimed at the development of flagellin- containing chemical protection against radiation damage.
Full Text
Введение. Широкое использование источников ионизирующих излучений в различных областях жизнедеятельности человека создаёт высокие риски возникновения чрезвычайных ситуаций и поражения людей радиацией. Проблема разработки медицинских средств противорадиационной защиты в таких ситуациях приобретает всё большую актуальность [3]. Кроме того, в связи с расширением применения лучевой терапии в лечении онкологических больных актуальной остаётся проблема защиты тканей, находящихся в зоне лучевого воздействия [6]. Известно значительное число соединений, проявляющих противолучевую активность [2, 3]: средства профилактики радиационных поражений (цистамин, нафизин, препарат «Б-190»), средства стимуляции радиорезистентности организма (рибоксин, дезоксинат, поливитаминные и витаминно-аминокислотные комплексы), средства ранней и экстренной терапии радиационных поражений (беталейкин), средства профилактики и купирования первичной реакции на облучение (латран), средства лечения острого костномозгового синдрома (амбен, серотонина адипинат, лейкостим, молграммастим) и др. Но большинство радиопротекторов оказывают эффективное действие лишь при их применении в субтоксических дозах [2], что существенно затрудняет их применение.
Сейчас в области радиационной фармакологии значительно возрос интерес к препаратам природного происхождения, одним из которых является белок филаментов бактерий – флагеллин, мощный активатор врождённого и адаптивного иммунитета. Флагеллин является единственным известным естественным лигандом толл-подобных рецепторов5 типа (toll-like receptor – TLR-5), локализованных на поверхности многих клеток иммунной системы (дендритных, макрофагов, нейтрофилов, Т-клеток) и разных типов эпителиальных клеток [1, 8, 9, 11]. По данным зарубежной и отечественной литературы, имеется множество сообщений о высокой радиозащитной эффективности как полноразмерного белка флагеллина, так и его делетированных форм – рекомбинантного флагеллина (рФЛ) [1, 4]. Одним из перспективных направлений является разработка новых фармакологических средств противорадиационной защиты на основе флагеллина и его производных форм [7, 8, 10, 11].
Цель исследования. В экспериментах на облученных крысах изучить в динамике влияние рФЛ на течение и исходы острого радиационного поражения (ОРП), а также показатели периферической крови.
Материалы и методы. Исследование радиозащитного действия рФЛ проводили в опытах in viv o на 84 крысах – самцах массой тела 200–240 г, полученных из питомника Российской академии медицинских наук «Рапполово» (пос. Рапполово Ленинградской обл.). После поступления из питомника животные в течение 14 сут содержались в карантине, затем были рандомизированы по группам, включающим 12 особей, и до окончания опыта находились в одинаковых условиях содержания и кормления. Кормление животных проводилось 1 раз в сут в первой половине дня без ограничения доступа к воде. Все манипуляции осуществлялись с соблюдением правил биоэтики при работе с лабораторными животными [5]. Для моделирования ОРП лабораторных животных подвергали однократному относительно равномерному гамма-облучению на установке «ИГУР-1» в дозе 6 Гр, что соответствовало летальной дозе 50% животных за 30-суточный период наблюдения (ЛД50/30). Оценивали течение и исходы ОРП по влиянию на 30-суточную выживаемость и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) облучённых крыс. Для оценки влияния рФЛ на гемопоэз облученных животных на 3-и, 9-е, 14-е и 25-е сут после облучения у животных из хвостовой вены забирали периферическую кровь. Общеклинический анализ периферической крови проводили на гемоанализаторе «Abacus Junior». В работе использовали рФЛ, синтезированный с использованием гена FliC, кодирующего разновидность флагеллина бактерий Salmonella enterica serovar Typhimurium, синтезированный в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов [4]. Рекомбинантный флагеллин вводили подкожно, в утренние часы, за 15–30 мин до и 15–30 мин после облучения лабораторных животных.
Полученные данные подвергали статистической обработке с вычислением среднего значения показателя и его ошибки. Достоверность различий средних значений показателей выживаемости оценивали с использованием точного метода Фишера,показателей средней продолжительности жизни погибших от облучения животных – по непараметрическому логранк-критерию, количество лейкоцитов периферической крови – с помощью U-критерия Манна – Уитни.
Результаты и их обсуждение. Выявлено, что профилактическое введение рФЛ улучшает течение и исходы ОРП крыс. Так, при облучении крыс в дозе 6 Гр выживаемость животных контрольной группы к 30-м суткам составила 50±14%, а величина СПЖ – 23±3 сут. В случае профилактического введения рФЛ в дозе 100 мкг/кг выживаемость облученных крыс увеличивалась на 33%, а величина СПЖ на 5 сут и составила 83±11% и 28±2 сут соответственно. Введение рФЛ в дозировках 1 и 10 мкг/кг оказалось малоэффективным (табл. 1).
Таблица 1
Влияние профилактического введения рФЛ на течение и исходы ОРП у крыс облученных в дозе 6 Гр
Группа | Доза препарата, мкг/кг | Выживаемость, % | СПЖ, сут |
Контрольная | – | 50±14 | 23±3 |
Получавшая рФЛ | 1 | 50±14 | 23±3 |
Получавшая рФЛ | 10 | 42±14 | 21±3 |
Получавшая рФЛ | 100 | 83±11* | 28±2 |
Примечание: * – различия по сравнению с контрольной группой, р≤0,05.
При введении рФЛ после облучения, радиозащитного действия препарата выявить не удалось. Так, в случае введения рФЛ в дозе 1 мкг/кг после облучения выживаемость составила 17±11%, а СПЖ составила 16±2 сут. Увеличение вводимой после облучения дозы рФЛ приводило к незначительному повышению выживаемости и СПЖ крыс. При введении рФЛ в дозе 10 и 100 мкг/кг выживаемость составила 33±14 и 50±14%, а СПЖ 21±2 и 22±3 сут соответственно (табл. 2).
Для изучения механизмов действия рФЛ исследовано его влияние на показатели периферической крови облучённых животных. У животных контрольной группы, облученных в дозе 6 Гр, в периферической крови отмечалась выраженная лейкопения. К 3-м сут после облучения отмечалось снижение уровня лейкоцитов до 5,1×109/л. По мере развития гематологического синдрома ОРП, лейкопения прогрессировала и к 9-м сут уровень лейкоцитов составил 3,2×109/л. На 14-е сут отмечалось постепенное восстановление пула лейкоцитов, при котором отмечалось увеличение показателя почти в 2 раза по сравнению с 9-ми сут, что составило 7×109/л. Восстановление уровня лейкоцитов дореферентных значений регистрировали к 25-м сут, когда их уровень составил 31×109/л.
Несколько иная картина наблюдалась при оценке показателей периферической крови у крыс, которым вводили рФЛ в дозе 100 мкг/кг до облучения. В этой группе животных, к 9-м сут после облучения уровень лейкоцитов составил 5,3×109/л, что на 40% больше по сравнению с группой контроля. К 14-м сут зафиксировано увеличение уровня лейкоцитов на 33% по сравнению с контрольной группой, что составило10,5×109/л. К 25-м сут в исследуемой группе отмечалась нормализация показателя до референтных значений, составившая 30,9×109/л, что существенно не отличалось от значения показателя в контрольной группе (рис.).
Рис. Уровень лейкоцитов в периферической крови крыс при профилактическом введении рФЛ в дозе 100 мкг/кг в разные сроки острого радиационного поражения
Все это свидетельствует о том, что введение рФЛ до облучения в дозе 100 мкг/кг оказывает защитное действие на кроветворные клетки и клетки костного мозга облученных крыс в дозе 6 Гр. Таким образом рФЛ оказывает выраженное радиозащитное действие у облученных крыс в условиях его профилактического применения в субтоксических дозах.
Полученные результаты подтверждают данные литературы о перспективности проведения дальнейших исследований, направленных на разработку флагеллинсодержащих средств химической защиты от лучевого поражения.
Выводы
- Рекомбинантный флагеллин оказывает выраженное радиозащитное действие при его введении лабораторным животным в дозе 100 мкг/кг подкожно за 15–30 мин до гамма-облучения в дозе 6 Гр. За 30-суточный период наблюдения рФЛ увеличивает выживаемость до 83% лабораторных животных при 50% гибели животных в контрольной группе.
- Введение рФЛ в дозе 1, 10, 100 мкг/кг подкожно, через 15–30 мин после облучения в дозе 6 Гр не оказывает радиозащитного эффекта. Применение рФЛ в дозе 1 и 10 мкг/кг усугубляет течение и исходы острого радиационного поражения. Так, в случае введения рФЛ в дозе 1 мкг/кг после облучения выживаемость составляет 17±11%, что на 33% ниже, чем в группе контроля.
- Профилактическое введение рФЛ в дозе 100 мкг/кг подкожно за 15–30 мин до облучения в дозе 6 Гр оказывает выраженное радиозащитное действие на кроветворные клетки и клетки костного мозга. Дозы рекомбинантного флагеллина ниже 100 мкг/кг при введении как до, так и после облучения не оказывают влияния на систему кроветворения облученных крыс в дозе 6 Гр.
About the authors
R. Yu. Sapozhnikov
Kirov Military medical academy
Author for correspondence.
Email: vestnikvmeda@mail.ru
Russian Federation, Saint Petersburg
Yu. Sh. Khalimov
Kirov Military medical academy
Email: vestnikvmeda@mail.ru
Russian Federation, Saint Petersburg
V. I. Legeza
Kirov Military medical academy
Email: vestnikvmeda@mail.ru
Russian Federation, Saint Petersburg
R. I. Litvinenko
Kirov Military medical academy
Email: vestnikvmeda@mail.ru
Russian Federation, Saint Petersburg
I. S. Drachev
State scientific-research test Institute of military medicine of Defense Ministry of the Russian Federation
Email: vestnikvmeda@mail.ru
Russian Federation, Saint Petersburg
S. Yu. Kraev
State scientific-research test Institute of military medicine of Defense Ministry of the Russian Federation
Email: vestnikvmeda@mail.ru
Russian Federation, Saint Petersburg
A. S. Simbirtsev
State Research Institute of Highly Pure Biopreparations
Email: vestnikvmeda@mail.ru
Russian Federation, Saint Petersburg
References
- Аль-Шехадат, Р.И. Получение и изучение свойств рекомби- нантного бактериального флагеллина / Р.И. Аль-Шехадат [и др.] // Хим. и биол. безопас. – 2012. – Спец. вып. – С.109–116.
- Васин, М.В. Классификация противолучевых средств как от- ражение современного состояния и перспективы развития радиационной фармакологии / М.В. Васин // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2013. – Т. 53, № 5. – С. 459–467.
- Владимиров, В.Г. О некоторых итогах и перспективах раз- вития профилактической радиационной фармакологии / В.Г. Владимиров, И.И. Красильников // Обзоры по клин. фармакол. и лек. терапии. – 2011. – Т. 9, № 1. – С. 44–50.
- Гребенюк, А.Н. Получение различных вариантов рекомбинант- ного флагеллина и оценка их радиозащитной эффектив- ности / А.Н. Гребенюк [и др.]. // Вестн. Росс. воен.-мед. акад. – 2013. – № 3 (43). – С. 75–80.
- Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. – СПб.: Rus-LASA «НП объединение специ- алистов по работе с лабораторными животными», рабочая группа по переводам и изданию тематической литературы, – 2012. – 48 с.
- Иванов, В.К. Радиационные риски медицинского облучения / В.К. Иванов, А.Ф. Цыб, Ф.А. Метлер // Радиация и риск. – 2011. – Т. 20, № 2. – С. 17–29.
- Рождественский, Л.М. Проблемные вопросы разработки противолучевых средств / Л.М. Рождественский // Радиац. биол. Радиоэкол. – 2019. – Т. 59. № 2. – С. 117–126.
- Burdelya, L.G. An agonist of toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse and primate models / L.G. Burdelya [et al.] // Science. – 2008. – Vol. 320, № 5873. – Р. 226–230.
- Chen, H. Activation of Toll-like receptors by intestinal microflora reduces radiation-induced DNA damage in mice / H. Chen [et al.] // Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. – 2014. – Vol. 774. – P. 22–28.
- Honko, A.N. Effects of flagellin on innate and adaptive immunity / A.N. Honko, S.B. Mizel // Immunol. Res. – 2005. – Vol. 33, № 1. – Р. 83–101.
- Li, W. CBLB502, an agonist of Toll-like receptor 5, has antioxidant and scavenging free radicals activities in vitro / W. Li [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. – 2016. – Vol. 82. – P. 97–103.
Supplementary files
