Mechanical preparation of the amniotic membrane in the creation of bioengineered structures for the restoration of corneal epithelium

I. O. Gavrilyuk; Гаврилюк И. О.; O. I. Aleksandrova; Александрова О. И.; A. Yu. Kuznetsova; Кузнецова А. Ю.; T. V. Mashel; Машель Т. В.; A. S. Seleznev; Селезнев А. С.; V. F. Chernysh; Черныш В. Ф.; S. V. Churashov; Чурашов С. В.; M. I. Blinova; Блинова М. И.; A. N. Kulikov; Куликов А. Н.

doi:10.17816/brmma20688

Mechanical preparation of the amniotic membrane in the creation of bioengineered structures for the restoration of corneal epithelium

Authors: Gavrilyuk I.O.¹, Aleksandrova O.I.², Kuznetsova A.Y.¹, Mashel T.V.²^,3, Seleznev A.S.¹, Chernysh V.F.¹, Churashov S.V.¹, Blinova M.I.², Kulikov A.N.¹
Affiliations:
1. Kirov Military medical academy
2. Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences
3. Peter the Great St.Petersburg Polytechnic University
Issue: Vol 21, No 4 (2019)
Pages: 116-120
Section: Articles
Submitted: 17.02.2020
Published: 15.12.2019
URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/20688
DOI: https://doi.org/10.17816/brmma20688
ID: 20688

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

The «gold standard» among biological and synthetic scaffolds for cultivation is the amniotic membrane. Its preparation for the needs of tissue engineering is associated with the difficulties of transporting and preserving the native amniotic membrane. The amniotic membrane was taken after elective caesarean section. The separated amniotic membrane was fixed according to our method [5]. Scaffolds were divided into 3 groups of 5 membranes each: storage under hypothermia, cryopreservation at –20 °C and –80 °C. Stem cells of the corneal epithelium of rabbits were used as a test system, and cells cultured under standard conditions were used as a control. Viability was determined using phase contrast microscopy and microtiter test. It has been suggested that the inhibition of the state of cells cultured on the amniotic membrane by the 14th day is associated with the viability of the own cells of the amniotic membrane. To verify this assumption, a microtiter test was carried out for all scaffold groups. The described method of immobilization of the amniotic membrane provides transportation, preservation and the possibility of culturing stem cells on the amniotic membrane. For the cultivation of stem cells during the first day, all three types of preservation of the amniotic membrane are suitable. In order to create bioengineered structures for restoration of the corneal epithelium, further research is needed to find the optimal way to de-epithelialize the amniotic membrane.

Keywords

amniotic membrane, tissue engineering, cell culture, cornea, cell-tissue transplant, corneal regeneration, stem cells, scaffold, reconstructive surgery

Full Text

Введение. Одной из нерешенных проблем современной офтальмологии является лечение пациентов, страдающих тотальным фиброваскулярным паннусом, возникшим по причине развития синдрома лимбальной недостаточности [7, 8, 10]. Зрительная реабилитация таких пациентов в настоящее время возможна только при помощи операции оптической кератопластики, которая в свою очередь неэффективна без удаления тотального фиброваскуллярного паннуса и восстановления нормального эпителиального покрова роговицы [2]. Наиболее перспективные для этого методики основаны на трансплантации культивированных стволовых клеток эпителия роговицы (СКЭР) или стволовых клеток эпителия полости рта (СКЭПР) на роговичную поверхность [2–4]. Успех такого способа реэпителизации роговицы напрямую зависит от использования не только эффективных факторов роста и подходящего источника клеточного материала при культивировании, но и оптимального субстрата для стволовых клеток (СК) [11].

В настоящее время считается, что «золотым стандартом» среди предложенного множества биологических и синтетических скаффолдов для культивирования является амниотическая мембрана (АМ) [11]. Она не только обладает противовоспалительными свойствами и содержит различные факторы роста и цитокины, индуцирующие эпителизацию и заживление ран, но и способна ингибировать патологическое субэпителиальное рубцевание. Кроме того, АМ гистологически напоминает боуменову мембрану роговицы и способна интегрироваться в роговичную строму [1, 6, 9, 12]. Вероятно, именно поэтому в иностранной литературе имеется множество сообщений о создании и применении биоинженерных конструкций (БИК) в виде клеточно-тканевых трансплантатов на основе АМ с культивированными СКЭР и СКЭПР. Однако методики подготовки АМ для этих целей не детализированы или вовсе не описаны.

Отсутствие в нашей стране отработанного протокола механической подготовки АМ для нужд тканевой инженерии связано со сложностями транспортировки и консервации нативной амниотической мембраны с целью создания на ее основе БИК с культивированными СК. Это связано с тем, что при транспортировке, консервировании, а также культивировании клеток на ее поверхности неиммобилизированная АМ, имеющая толщину около 30 мкм, легко деформируется и сворачивается в тканевой конгломерат. Ее сложно поддерживать в расправленном состоянии. Это затрудняет определение подходящей для культивирования и трансплантации стороны АМ и может быть причиной неэффективной ее консервации, сложности посева клеток на ее поверхность и неравномерного распределения культивируемых клеток.

Цель исследования. Обосновать возможность механической подготовки амниотической мембраны при создании биоинженерных конструкций для восстановления эпителия роговицы.

Материалы и методы. Забор амниотической оболочки выполняли в стерильных условиях операционной после планового кесарева сечения. Перед забором АМ получали согласие рожениц. АМ выделяли путем механического отделения ее от спонгиозного слоя амниона (рис. 1).

Рис. 1. Механическое отделение АМ

Далее полученную мембрану механически фиксировали (рис. 2) в расправленном состоянии к гладким краям стерильной чашки Петри диаметром3 см со срезанным дном при помощи стерильного зажимного хомута [5].

Рис. 2. Этапы фиксации АМ согласно патенту № RU 2680471. а, б, в – нативная АМ в расправленном состоянии укладывается на гладкие края стерильной чашки Петри диаметром 3 см со срезанным дном; г – АМ механически фиксируется при помощи стерильного зажимного хомута; д – нефиксированной части АМ отсекается; е – вид фиксированной АМ

Подготовленные таким образом скаффолды из нативной АМ помещались в транспортный раствор (1 г цефтриаксона на 100 мл раствора NaCl) и доставлялись в Центр клеточных технологий института цитологии Российской академии наук с целью определения возможности банкирования (методом криоконсервации) фиксированных АМ и культивирования на них стволовых клеток.

Для определения возможности криобанкирования подготовленные скаффолды на основе АМ были разделены на 3 группы по 5 мембран в каждой: 1-я основная (хранение в условиях гипотермии при+4°С), 2-я основная (криоконсервирование при–20°С) и 3-я основная (криоконсервирование при–80°С). Среда для криоконсервации состояла из среды Дульбекко с добавлением питательной среды«F12» фирмы «Gibco» (Соединённые Штаты Америки– США) и диметилсульфоксида в соотношении 1:1.

Для определения возможности культивирования СК на исследуемых скаффолдах в качестве тестсистемы использовали популяции СКЭР кроликов. Клетки высевали на поверхность фиксированной АМ и культивировали их в инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа в течение двух недель. В качестве контроля использовали клетки, культивируемые в стандартных условиях. Жизнеспособность клеток оценивали по их морфологии и функциональной активности с использованием фазово-контрастной микроскопии (ФКМ) и микротитрационной пробы (МТП). Прижизненное наблюдение с фотофиксацией в процессе культивирования клеток осуществляли под инвертированным микроскопом «Eclipse TS100» фирмы «Nikon» (Япония), оснащенным фотокамерой. МТП проводили с помощью анализатора «Fluorofot» фирмы «Charity» (Россия) при длине волны 570 нм и референтной длине волны 630 нм.

Математическую обработку полученных данных проводили методами вариационной статистики при помощи программы Microsoft Exel 2007 с определением показателей: среднего значения (М), ошибки среднего (m), достоверности различий между группами сравнения с вычислением критерия Стьюдента (t) и уровня значимости (α), доверительного интервала (р). Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты и их обсуждение. Подготовленные скаффолды АМ после транспортировки, криоконсервирования и разморозки остались надежно фиксированными, хорошо расправленными и сохраняли прежние оптические свойства, что создавало благоприятные условия для посева и культивирования клеток. Скаффолды помещали в чашки Петри большего диаметра и наносили на их поверхность суспензию СКЭР в модифицированной среде Дульбекко с добавлением питательной среды « F12» фирмы «Gibco» (США), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Клетки хорошо адгезировали на поверхность скаффолдов всех групп и через одни сутки были хорошо распластаны. Однако при дальнейшем культивировании были выявлены различия в морфологии клеток и характере их прикрепления к скаффолдам (рис. 3).

Рис. 3. СКЭР на 3-и и 14-е сутки культивирования на АМ в трех группах: а – нативная АМ +4°С; б – криоконсервированная АМ –20°С; в – криоконсервированная АМ –80°С. Ув. ×4 (фазово-контрастная микроскопия)

На 3-и сутки культивирования в контроле клетки хорошо распластаны и сформировали субконфлюентный монослой. Ни на одном из скаффолдов монослой сформирован не был. Наиболее близким к контролю было морфологическое состояние клетокв третьей группе. Во второй группе часть клеток была распластана, но наблюдалось много округлившихся клеток. В первой группе распластанных клеток на 3-и сутки культивирования не выявлено.

На 14-е сутки во второй группе наблюдались лишь единичные распластанные клетки. В третьей группе клеток мало, они распластаны хуже, чем на 3-и сутки культивирования, их морфология свидетельствует об угнетенном состоянии.

Таким образом, к 14-м суткам культивирования жизнеспособные клетки остались в небольшом количестве только на АМ криоконсервированной при–80°С. Можно предположить, что угнетенное состояние культивируемых на АМ клеток связано с жизнеспособностью собственных клеток АМ.

Для проверки этой гипотезы была проведёна МТП для всех групп скаффолдов, чтобы выявить метаболическую активность клеток амниотического эпителия.

Выявлено, что наименьшее количество выживших клеток АМ наблюдается в скаффолдах криоконсервированных при –80°С (рис. 4).

Рис. 4. Результаты МТП для трех групп скаффолдов на основе АМ. За 100% приняты показатели нативной АМ

Применение описанного способа иммобилизации нативной АМ обеспечивает транспортировку, консервацию и применение ее в качестве носителя культивированных СК путем создания надежной фиксации подложки-носителя клеток в жидких системах, что предотвращает ее деформацию в результате движения жидкостей в условиях транспортировки и консервации. Способ позволяет применить нативную или консервированную АМ в качестве носителя клеток.

Среди технических особенностей такого способа, обеспечивающих надежную фиксацию нативной АМ, можно выделить следующие. Во-первых, стерильная чашка Петри является прочной, ареагенной деталью, входящей в состав одноразового стерильного зажимного устройства, которая изготавливается в стерильных условиях или вторично стерилизующаяся. Она не влияет на условия культивирования клеток, изза широкой наружной поверхности дает возможность надежно зафиксировать нативную АМ и исключает контаминацию АМ и/или культивируемых на ней клеток. Во-вторых, одноразовый стерильный зажимной хомут позволяет надежно зафиксировать нативную АМ без риска нарушения ее стерильности, при этом его ширина соответствует ширине наружной поверхности ободка подготовленной чашки Петри, что создает условия для максимально надежной фиксации. При этом АМ фиксируется с запасом, равным по размеру не меньше, чем ширина одноразового стерильного зажимного хомута, что исключает возможность соскальзывания АМ с гладких краев ободка чашки Петри.

Надежная плотная фиксация АМ обеспечивает герметичность конструкции (АМ с устройством для зажима), что создает оптимальные условия для посева и культивирования клеток, обеспечивая создание БИК на основе АМ.

Заключение. Для культивирования клеток в течение первых суток подходят все три вида консервации АМ. При более длительных сроках культивирования наблюдается угнетение культивируемых клеток. Для длительных сроков культивирования наиболее подходящей из исследуемых вариантов является криоконсервирование АМ при –80оС. Угнетение культивируемых клеток связано с жизнеспособностью собственных клеток АМ. Поэтому с целью создания БИК для восстановления эпителия роговицы необходимо продолжение исследований, направленных на поиск оптимального способа деэпителизации АМ.