The study of biodegradation of thermo-polimerized collagen gels

Abstract


The possibility of biodegradation of thermopolymerizable collagen gel (without cultured stem cells) in various concentrations is considered. In an experiment, an unpolymerized collagen gel was injected into the conjunctival cavity during preliminary blepharography. A polymerized collagen gel was obtained by incubating a thermopolymerizing collagen gel at37°C for 30 min until complete polymerization, then the gel was placed on the ocular surface and fixed by blepharography. Collagen gel biodegradation was evaluated at the 1st and 4th hours after surgery. Evaluation criteria: visually by the change in the volume of the plugged conjunctival cavity, leakage of fluid through the intershoot spaces, and also 12 hours after the operation according to the volume of collagen gel remaining in the conjunctival cavity (after removal of blepharoraphic sutures). It was revealed that biodegradation of thermally polarizable collagen gel is carried out by the mechanism of its dehydration regardless of the state of the implanted gel (unpolymerized/polymerized). The volume of the dehydrated collagen framework is directly proportional to its concentration. To increase the biodegradation time of a thermopolarizable collagen gel, it is advisable to develop a method for retaining fluid inside the collagen frame.

Full Text

Введение. На сегодняшний день одним из акту- альных направлений развития отечественной офталь- мологии представляется реконструктивная хирургия глазной поверхности, результатом которой является зрительная реабилитация пациентов, в том числе с тотальными сосудистыми помутнениями [1]. Перспек- тивные для достижения такого результата способы основаны на восстановлении нормального эпители- ального покрова глазной поверхности [2]. Для этого в мировой офтальмологии с успехом применяется трансплантация культивированных эпителиальных стволовых клеток: лимбальных эпителиальных ство- ловых клеток (ЛЭСК) и стволовых клеток эпителия по- лости рта [2-4]. Такая трансплантация осуществляется на различных подложках-носителях клеток. В качестве последних особого внимания заслуживает скаффолд, изготовленный из термополимеризующегося колла- генового геля [5]. Ввиду своих физико-химических свойств он позволяет культивировать стволовые клетки в 3D-условиях. Однако существенным его ми- нусом является быстрая биодеградация, несмотря на длительное сохранение в in vitro условиях. Так, в проведенном ранее исследовании было установлено, что полимеризованный коллагеновый скаффолд (с концентрацией 2 мг/мл), заселенный культивируе- мыми ЛЭСК и трансплантированный на роговичную поверхность, биодеградирует в течение 3 суток [3]. Этого, как оказалось, недостаточно для приживления культивированных стволовых клеток. Поэтому соз- дание депо культивированных клеток, достаточного для восстановления эпителия роговичного феноти- па, становится возможным только после повторной трансплантации ЛЭСК на данном скаффолде. В связи с этим представляется перспективной разработка более устойчивого к биодеградации в in vitro условиях носителя культивированных эпителиальных стволовых клеток (СК) на основе коллагена. Цель исследования. Определить время биоде- градации термополимеризующегося коллагенового геля без культивируемых стволовых клеток в различ- ных концентрациях. Материалы и методы. Исследование выполнено на 15 половозрелых кроликах (30 глаз) породы шин- шилла массой 2,5-3,5 кг. Для достижения поставлен- ной цели в эксперименте изучалась биодеградация термополимеризующегося коллагенового геля в концентрациях 2, 3, 4 мг/мл в неполимеризованном (полимеризующегося в условиях in vivo) и полимериз- ванном (в условиях in vitro) состояниях. Объем вво- димого в конъюнктивальную полость коллагенового геля составлял 3,5-4,5 мл, что соответствует объему конъюнктивальной полости кролика. Для этого глаза 138 1 (69) - 2020 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования были разделены на две группы по 15 глаз в каждой. В 1-ю группу вошли правые глаза животных, на которых предварительно выполняли временную блефарора- фию с герметизирующей целью, после чего в конъюн- ктивальную полость при помощи инсулинового шприца имплантировали неполимеризованный коллагеновый гель в концентрациях 2 мг/мл (1-я подгруппа, 5 глаз), 3 мг/мл (2-я подгруппа, 5 глаз) и 4 мг/мл (3-я подгруппа, 5 глаз). Во 2-ю группу вошли левые глаза животных, в конъюнктивальную полость которых имплантировали предварительно полимеризованный в условиях in vitro коллагеновый гель в концентрациях 2 мг/мл (4-я под- группа, 5 глаз), 3 мг/мл (5-я подгруппа, 5 глаз) и 4 мг/мл (6-я подгруппа, 5 глаз) с последующим выполнением временной блефарорафии с герметизирующей целью. Все оперативные вмешательства выполняли под местной инфильтрационной (2% раствором лидока- ина) и инстилляционной (0,5% раствором алкаина) анестезией. Для приготовления термополимеризующегося коллагенового геля использовали препарат «Коллаген I типа желирующий», являющийся раствором интакт- ного нативного коллагена I типа. Препарат был полу- чен в Институте цитологии Российской академии наук (Санкт-Петербург) в процессе кислотной экстракции из сухожилий крысиного хвоста. Для приготовления геля смешивали «Коллаген I типа желирующий», концентри- рованную (10х) среду 199 фирмы «Gibco» (Соединенные Штаты Америки - США) и стерильный 0,34 H раствор NaOH фирмы «Sigma» (США). Конечная концентрация коллагена достигала 2, 3 и 4 мг/мл и транспортирова- лась в клинику офтальмологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (ВМА) в условиях гипотермии (при 2-4оС) в неполимеризованном состоянии. Для полимеризации полученного геля в услови- ях in vitro использовали чашки Петри диаметром 30 мм, в которые помещали термополимеризующийся коллагеновый гель и инкубировали его при 37°С в течение 30 мин до полной полимеризации. Конечная концентрация коллагена достигала 2, 3 и 4 мг/мл и транспортировалась в клинику офтальмологии ВМА в полимеризованном состоянии. Техника выполнения операции по имплантации не- полимеризованного коллагенового геля основана на введении его через инсулиновый шприц (без канюли) в предварительно герметизированную конъюнкти- вальную полость (рис. 1). Техника выполнения операции по имплантации полимеризованного коллагенового геля основана на помещении его в конъюнктивальную полость с последующим наложением герметизирующей бле- фарорафии (рис. 2). Рис. 1. Техника выполнения операции по имплантации неполимеризованного коллагенового геля: а - наложение блефарорафических швов; б - герметизирующая блефарорафия; в - введение неполимеризованного коллагенового геля в конъюнктивальную полость Рис. 2. Техника выполнения операции по имплантации полимеризованного коллагенового геля: а - укладка полимеризованного коллагенового геля на глазную поверхность; б - гель расправлен по глазной поверхности; в - герметизирующая блефарорафия ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 1 (69) - 2020 139 Экспериментальные исследования Биодеградицию коллагенового геля на 1-й и 4-й ч после операции оценивали визуально по изменению объема тампонированной конъюнктивальной по- лости и просачиванию жидкости через межшовные промежутки, а также через 12 ч после операции по оставшемуся в конъюнктивальной полости объему коллагенового геля (после снятия блефарорафиче- ских швов). Результаты и их обсуждение. Через 1 час после операции объемы тампонированных конъюнктиваль- ных полостей во всех подгруппах были одинаковы, веки при пальпации плотноэластической консистен- ции, герметичны, просачивания жидкости через меж- шовные промежутки не наблюдалось. На 4-м ч после операции в 1-й группе на всех глазах отмечалось уменьшение объема тампонированной конъюнктивальной полости, наблюдалось просачи- вание жидкости через блефарорафические швы. При этом веки теряли упругость, при пальпации имели мягкоэластичесую консистенцию. Вместе с тем во 2-й группе на всех глазах веки оставались плотноэла- стической консистенции, были герметичны, не имели признаков просачивания жидкости через межшовные промежутки. Спустя 12 ч во всех группах имело место уменьше- ние объема тампонированной конъюнктивальной по- лости. Поэтому для оценки биодеградации коллагено- вого геля ревизия конъюнктивальных полостей была выполнена после снятия блефарорафических швов. Оказалось, что в 1-й и 2-й подгруппах 1-й группы коллагеновый гель полностью биодеградировал. При этом в 3-й подгруппе определялась частичная дегра- дация имплантированного геля. В конъюнктивальных полостях глаз этой подгруппы обнаруживался обезво- женный коллагеновый каркас, что свидетельствует о биодеградации, протекающей преимущественно по механизму дегидратации (рис. 3). Во 2-й группе биодеградация полимеризованного в условиях in vitro коллагенового геля также проис- ходила по механизму потери жидкости. Во всех под- группах в конъюнктивальных полостях обнаруживался дегидратированный коллагеновый каркас, объем которого коррелировал с концентрацией исходного имплантированного геля (рис. 4). Выводы 1. Биодеградация термополимеризующегося коллагенового геля независимо от состояния им- плантированного геля (неполимеризованный/поли- Рис. 3. Биодеградация неполимеризованного коллагенового геля (1-я группа): а - 1-я подгруппа (2 мг/мл); б - 2-я подгруппа (3 мг/мл); в - 3-я подгруппа (4 мг/мл). Белой стрелкой показан дегидратированный коллагеновый каркас Рис. 4. Биодеградация полимеризованного коллагенового геля (2-я группа): а - 4-я подгруппа (2 мг/мл); б - 5-я подгруппа (3 мг/мл); в - 6-я подгруппа (4 мг/мл). Белой стрелкой показаны дегидратированные коллагеновые каркасы 140 1 (69) - 2020 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования меризованный) осуществляется по механизму его дегидратации. 2. Объем дегидратированного коллагенового кар- каса, обнаруженного через 12 ч после имплантации термополимеризующегося коллагенового геля, прямо пропорционален его концентрации. 3. Для увеличения времени биодеградации тер- мополимеризующегося коллагенового геля целесо- образна разработка способа удержания жидкости внутри коллагенового каркаса.

References

  1. Безушко, А.В. Исследование возможности применения культивированных аутологичных лимбальных эпителиаль- ных стволовых клеток на коллагеновом скаффолде для устранения лимбальной недостаточности в эксперименте / А.В. Безушко [и др.] // Практ. мед. - 2017. - Т. 2, № 110. - С. 32-37.
  2. Гаврилюк, И.О. К вопросу о заборе, выделении и культивиро- вании стволовых клеток эпителия слизистой полости рта / И.О. Гаврилюк [и др.] // Соврем. технол. в офтальмол. - 2018. - № 4. - С. 60-63.
  3. Горбачев, Д.С. Особенности реконструктивной хирургии вспомогательных органов глаза при боевых повреждениях органа зрения / Д.С. Горбачев [и др.] // Соврем. технол. в офтальмол. - 2016. - № 3. - С. 99-101.
  4. Дубовиков, А.С. Лимбальная недостаточность: этиология, па- тогенез, принципы и перспективы хирургического лечения / А.С. Дубовиков [и др.] // Росс. офтальм. журн. - 2019. - Т. 12, № 1. - С. 103-111.
  5. Nakamura, T. Ocular surface reconstruction using stem cell and tissue engineering / T. Nakamura [et al.] // Prog. Retin. Eye Res. - 2016. - Vol. 5. - P. 187-207.

Statistics

Views

Abstract - 89

PDF (Russian) - 12

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX

Dimensions


Copyright (c) 2020 Smirnova V.F., Gavrilyuk I.O., Aleksandrova O.I., Vasiliev A.S., Mashel T.V., Churashov S.V., Chernysh V.F., Blinova M.I., Kulikov A.N.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies