Исследование биодеградации термополимеризующегося коллагенового геля

Полный текст

Введение. На сегодняшний день одним из акту- альных направлений развития отечественной офталь- мологии представляется реконструктивная хирургия глазной поверхности, результатом которой является зрительная реабилитация пациентов, в том числе с тотальными сосудистыми помутнениями [1]. Перспек- тивные для достижения такого результата способы основаны на восстановлении нормального эпители- ального покрова глазной поверхности [2]. Для этого в мировой офтальмологии с успехом применяется трансплантация культивированных эпителиальных стволовых клеток: лимбальных эпителиальных ство- ловых клеток (ЛЭСК) и стволовых клеток эпителия по- лости рта [2-4]. Такая трансплантация осуществляется на различных подложках-носителях клеток. В качестве последних особого внимания заслуживает скаффолд, изготовленный из термополимеризующегося колла- генового геля [5]. Ввиду своих физико-химических свойств он позволяет культивировать стволовые клетки в 3D-условиях. Однако существенным его ми- нусом является быстрая биодеградация, несмотря на длительное сохранение в in vitro условиях. Так, в проведенном ранее исследовании было установлено, что полимеризованный коллагеновый скаффолд (с концентрацией 2 мг/мл), заселенный культивируе- мыми ЛЭСК и трансплантированный на роговичную поверхность, биодеградирует в течение 3 суток [3]. Этого, как оказалось, недостаточно для приживления культивированных стволовых клеток. Поэтому соз- дание депо культивированных клеток, достаточного для восстановления эпителия роговичного феноти- па, становится возможным только после повторной трансплантации ЛЭСК на данном скаффолде. В связи с этим представляется перспективной разработка более устойчивого к биодеградации в in vitro условиях носителя культивированных эпителиальных стволовых клеток (СК) на основе коллагена. Цель исследования. Определить время биоде- градации термополимеризующегося коллагенового геля без культивируемых стволовых клеток в различ- ных концентрациях. Материалы и методы. Исследование выполнено на 15 половозрелых кроликах (30 глаз) породы шин- шилла массой 2,5-3,5 кг. Для достижения поставлен- ной цели в эксперименте изучалась биодеградация термополимеризующегося коллагенового геля в концентрациях 2, 3, 4 мг/мл в неполимеризованном (полимеризующегося в условиях in vivo) и полимериз- ванном (в условиях in vitro) состояниях. Объем вво- димого в конъюнктивальную полость коллагенового геля составлял 3,5-4,5 мл, что соответствует объему конъюнктивальной полости кролика. Для этого глаза 138 1 (69) - 2020 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования были разделены на две группы по 15 глаз в каждой. В 1-ю группу вошли правые глаза животных, на которых предварительно выполняли временную блефарора- фию с герметизирующей целью, после чего в конъюн- ктивальную полость при помощи инсулинового шприца имплантировали неполимеризованный коллагеновый гель в концентрациях 2 мг/мл (1-я подгруппа, 5 глаз), 3 мг/мл (2-я подгруппа, 5 глаз) и 4 мг/мл (3-я подгруппа, 5 глаз). Во 2-ю группу вошли левые глаза животных, в конъюнктивальную полость которых имплантировали предварительно полимеризованный в условиях in vitro коллагеновый гель в концентрациях 2 мг/мл (4-я под- группа, 5 глаз), 3 мг/мл (5-я подгруппа, 5 глаз) и 4 мг/мл (6-я подгруппа, 5 глаз) с последующим выполнением временной блефарорафии с герметизирующей целью. Все оперативные вмешательства выполняли под местной инфильтрационной (2% раствором лидока- ина) и инстилляционной (0,5% раствором алкаина) анестезией. Для приготовления термополимеризующегося коллагенового геля использовали препарат «Коллаген I типа желирующий», являющийся раствором интакт- ного нативного коллагена I типа. Препарат был полу- чен в Институте цитологии Российской академии наук (Санкт-Петербург) в процессе кислотной экстракции из сухожилий крысиного хвоста. Для приготовления геля смешивали «Коллаген I типа желирующий», концентри- рованную (10х) среду 199 фирмы «Gibco» (Соединенные Штаты Америки - США) и стерильный 0,34 H раствор NaOH фирмы «Sigma» (США). Конечная концентрация коллагена достигала 2, 3 и 4 мг/мл и транспортирова- лась в клинику офтальмологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (ВМА) в условиях гипотермии (при 2-4оС) в неполимеризованном состоянии. Для полимеризации полученного геля в услови- ях in vitro использовали чашки Петри диаметром 30 мм, в которые помещали термополимеризующийся коллагеновый гель и инкубировали его при 37°С в течение 30 мин до полной полимеризации. Конечная концентрация коллагена достигала 2, 3 и 4 мг/мл и транспортировалась в клинику офтальмологии ВМА в полимеризованном состоянии. Техника выполнения операции по имплантации не- полимеризованного коллагенового геля основана на введении его через инсулиновый шприц (без канюли) в предварительно герметизированную конъюнкти- вальную полость (рис. 1). Техника выполнения операции по имплантации полимеризованного коллагенового геля основана на помещении его в конъюнктивальную полость с последующим наложением герметизирующей бле- фарорафии (рис. 2). Рис. 1. Техника выполнения операции по имплантации неполимеризованного коллагенового геля: а - наложение блефарорафических швов; б - герметизирующая блефарорафия; в - введение неполимеризованного коллагенового геля в конъюнктивальную полость Рис. 2. Техника выполнения операции по имплантации полимеризованного коллагенового геля: а - укладка полимеризованного коллагенового геля на глазную поверхность; б - гель расправлен по глазной поверхности; в - герметизирующая блефарорафия ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ 1 (69) - 2020 139 Экспериментальные исследования Биодеградицию коллагенового геля на 1-й и 4-й ч после операции оценивали визуально по изменению объема тампонированной конъюнктивальной по- лости и просачиванию жидкости через межшовные промежутки, а также через 12 ч после операции по оставшемуся в конъюнктивальной полости объему коллагенового геля (после снятия блефарорафиче- ских швов). Результаты и их обсуждение. Через 1 час после операции объемы тампонированных конъюнктиваль- ных полостей во всех подгруппах были одинаковы, веки при пальпации плотноэластической консистен- ции, герметичны, просачивания жидкости через меж- шовные промежутки не наблюдалось. На 4-м ч после операции в 1-й группе на всех глазах отмечалось уменьшение объема тампонированной конъюнктивальной полости, наблюдалось просачи- вание жидкости через блефарорафические швы. При этом веки теряли упругость, при пальпации имели мягкоэластичесую консистенцию. Вместе с тем во 2-й группе на всех глазах веки оставались плотноэла- стической консистенции, были герметичны, не имели признаков просачивания жидкости через межшовные промежутки. Спустя 12 ч во всех группах имело место уменьше- ние объема тампонированной конъюнктивальной по- лости. Поэтому для оценки биодеградации коллагено- вого геля ревизия конъюнктивальных полостей была выполнена после снятия блефарорафических швов. Оказалось, что в 1-й и 2-й подгруппах 1-й группы коллагеновый гель полностью биодеградировал. При этом в 3-й подгруппе определялась частичная дегра- дация имплантированного геля. В конъюнктивальных полостях глаз этой подгруппы обнаруживался обезво- женный коллагеновый каркас, что свидетельствует о биодеградации, протекающей преимущественно по механизму дегидратации (рис. 3). Во 2-й группе биодеградация полимеризованного в условиях in vitro коллагенового геля также проис- ходила по механизму потери жидкости. Во всех под- группах в конъюнктивальных полостях обнаруживался дегидратированный коллагеновый каркас, объем которого коррелировал с концентрацией исходного имплантированного геля (рис. 4). Выводы 1. Биодеградация термополимеризующегося коллагенового геля независимо от состояния им- плантированного геля (неполимеризованный/поли- Рис. 3. Биодеградация неполимеризованного коллагенового геля (1-я группа): а - 1-я подгруппа (2 мг/мл); б - 2-я подгруппа (3 мг/мл); в - 3-я подгруппа (4 мг/мл). Белой стрелкой показан дегидратированный коллагеновый каркас Рис. 4. Биодеградация полимеризованного коллагенового геля (2-я группа): а - 4-я подгруппа (2 мг/мл); б - 5-я подгруппа (3 мг/мл); в - 6-я подгруппа (4 мг/мл). Белой стрелкой показаны дегидратированные коллагеновые каркасы 140 1 (69) - 2020 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ Экспериментальные исследования меризованный) осуществляется по механизму его дегидратации. 2. Объем дегидратированного коллагенового кар- каса, обнаруженного через 12 ч после имплантации термополимеризующегося коллагенового геля, прямо пропорционален его концентрации. 3. Для увеличения времени биодеградации тер- мополимеризующегося коллагенового геля целесо- образна разработка способа удержания жидкости внутри коллагенового каркаса.

Об авторах

В Ф Смирнова

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

И О Гаврилюк

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

О И Александрова

Институт цитологии Российской академии наук

Санкт-Петербург

А С Васильев

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

Т В Машель

Институт цитологии Российской академии наук; Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого

Санкт-Петербург

С В Чурашов

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

В Ф Черныш

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

М И Блинова

Институт цитологии Российской академии наук

Санкт-Петербург

А Н Куликов

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vmeda-nio@mil.ru
Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы