Динамика содержания цитокинов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости у крыс при острой ингаляционной интоксикации хлором и продуктами пиролиза, содержащими хлороводород

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Известно, что ингаляционное воздействие хлора и хлороводорода приводит к поражению дыхательной системы вплоть до развития острого легочного отека у пострадавших. На сегодняшний день данных по механизмам развития отека легких при воздействии хлороводорода в доступной литературе обнаружить не удалось. Исследование выполнено на белых беспородных крысах-самцах, которые были разделены на 3 группы: группа I – контроль; группа II — животных подвергали интоксикации хлором в дозе 1,5 среднелетальной концентрации (30 мин); группа III — животных подвергали интоксикации хлороводородом в дозе 1,5 среднелетальной концентрации (30 мин). Сразу после воздействия исследуемых токсикантов, а также через 1, 3 и 6 ч у животных определяли величину легочного коэффициента и содержание цитокинов (интерлейкинов-1β, 6, 10 и интерферона-γ) в бронхоальвеолярной лаважной жидкости. Выявлено, что увеличение легочного коэффициента (p < 0,05) у животных в группах II и III сопровождается значимым увеличением (в 1,5 раза) содержания исследуемых цитокинов в бронхиально-альвеолярной лаважной жидкости по сравнению с животными группы I. У животных в группе III увеличение (p < 0,05) содержания цитокинов регистрируется позже — только через 3 ч после воздействия, при этом оно значимо ниже, по сравнению с животными группы II во все исследуемые сроки. Таким образом, интоксикация хлороводородом приводит к более медленному развитию отека легких и нарастанию содержания как про- (интерлейкины-1β, 6), так и противовоспалительных цитокинов (интерлейкин-10, интерферон-γ) в бронхиально-альвеолярной лаважной жидкости по сравнению с животными, подвергшимися интоксикации хлором.

Полный текст

Введение

Ингаляционное поступление пульмонотоксикантов (хлор (Cl2)), хлороводород (HCl), диоксид азота, дихлорангидрид угольной кислоты и др.) приводит к нарушению функции дыхательной системы вплоть до развития острого легочного отека [1, 2]. Под острым легочным отеком следует понимать нозологическую единицу, принятую в Международной классификации болезней 10-го пересмотра (J68.1 — острый легочный отек, вызванный химическими веществами, газами, дымами и парами) [3].

Гидрофильные пульмонотоксиканты хорошо растворяются в воде с образованием соответствующих кислот. Так, хлор, поступая в организм ингаляционным путем, взаимодействует с водой слизистых оболочек с образованием соляной и хлорноватистой кислот [2, 4], которые проникают в глубокие отделы дыхательных путей вплоть до альвеол и оказывают повреждающее действие, денатурируют компоненты альвеолярно-капиллярной мембраны (АКМ).

В литературе описаны механизмы раздражающего действия Cl2 и HCl на верхние дыхательные пути [4, 5]. Однако данных о механизмах пульмонотоксического действия HCl, приводящего к развитию токсического отека легких, в доступной литературе обнаружить не удалось.

При проведении предварительных экспериментальных исследований были выявлены различия по скорости нарастания и выраженности отека легких при моделировании ингаляционной интоксикации лабораторных животных Cl2 и HCl в одинаковых токсических дозах [6].

Важную роль в развитии токсического отека легких при интоксикации Cl2 и HCl играет каскад воспалительных реакций [7]. В качестве главных медиаторов развития местной воспалительной реакции острофазового ответа рассматривают интерлейкин-1β (IL-1β) и IL-6, накопление которых в тканях легких приводит к увеличению притока нейтрофилов [8] и манифестации отека [9]. В свою очередь IL-10 и интерферон-γ (IFN-γ) представляют собой ингибиторы иммунного ответа, увеличение которых можно рассматривать как компенсаторную реакцию [8].

Динамика содержания цитокинов в процессе развития токсического отека легких при интоксикации животных Cl2 и HCl может отражать механизмы токсического действия данных пульмонотоксикантов.

Цель исследования — изучить динамику содержания цитокинов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости лабораторных животных при острой ингаляционной интоксикации HCl и Cl2.

Материалы и методы

Экспериментальное исследование выполнено на белых беспородных крысах-самцах (n = 86) массой 200 ÷ 220 г. Животных разделили на 3 группы: группа I — контроль — животные находились в ингаляционной камере в течение 30 мин, дышали атмосферным воздухом; группа II — животных подвергали интоксикации Cl2 в дозе 1,5 среднелетальной концентрации (LC50) в течение 30 мин; группа III — животных подвергали интоксикации HCl (1,5 LC50, 30 мин). При проведении экспериментов выполняли требования нормативно-правовых актов о порядке экспериментальной работы с использованием животных, в том числе по гуманному отношению к ним [10]. Выведение животных из эксперимента осуществляли передозировкой раствора золетила фирмы Virbac Sante Animale (Франция).

Статическую ингаляционную интоксикацию лабораторных животных моделировали в герметичной ингаляционной камере объемом 0,1 м3. Хлороводород получали путем термодеструкции хлорированного парафина в камере для пиролиза при температуре 180 ÷ 350 оС в течение 5 мин. Содержание HCl в ингаляционной камере определяли при помощи газоанализатора Porta Sens II (Analytical Technology, Соединенные Штаты Америки), монооксида углерода и кислорода — при помощи газоанализатора ДАХ-М фирмы «Аналит-Прибор» (Россия). Хлор получали химическим способом. Концентрацию Cl2 в камере определяли расчетным методом.

В предварительных экспериментах методом пробит-анализа по Финни [12] с использованием пакета программ Statistica 10.0 (StatSoft, США) определяли среднелетальную концентрацию токсикантов по критерию 3-суточной выживаемости лабораторных животных. Установлено, что LC50 для крыс при интоксикации Cl2 составила 680 [610; 740] ppm, при воздействии HCl — 7670 [7020; 8150] ppm (экспозиция — 30 мин).

В настоящем исследовании животных подвергали статической ингаляционной интоксикации исследуемыми токсикантами в токсодозах, соответствующих 1,5 LCt50. После окончания воздействия животных извлекали из ингаляционной камеры, и они дышали атмосферным воздухом. Наблюдение за животными осуществляли в течение 6 ч. Животных выводили из эксперимента через 0,1, 1, 3 и 6 ч после воздействия токсикантов. Содержание внесосудистой воды легких определяли путем измерения легочного коэффициента (ЛК) [1].

В отдельной серии экспериментов у животных, подвергшихся интоксикации, через 0,1, 1, 3 и 6 ч после воздействия проводили забор бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) по методу Brain и Beck [11]. В БАЛЖ определяли содержание цитокинов с помощью многопараметрического иммунофлуоресцентного метода по технологии Luminex xMAP. Для определения цитокинов IL-1β, IL-6, IL-10, IFN-γ использовали 9-плексный набор на цитокины крысы (Bio-Plex Rat cytokine 9-plex A panel, кат. № 171K11070, Bio-Rad). Подготовку образцов для иммунофлуоресцентного анализа и определение цитокинов проводили с помощью иммунофлуоресцентного анализатора Bio-Plex 200 (Bio-Rad, Франция / Соединенные Штаты Америки) по протоколам фирмы-производителя набора реактивов и оборудования.

Статистический анализ результатов исследований проводили при помощи программ Statistica 5.0, 10.0. Данные в тексте представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей (Me [Q25; Q75]). Для сравнения количественных признаков, распределение которых отличалось от нормального, использовали непараметрический критерий Краскела – Уоллиса и критерий Ньюмена – Кейлса для множественных попарных сравнений. Статистическую значимость различий между группами принимали при p < 0,05.

Результаты и их обсуждение

При моделировании интоксикации лабораторных животных продуктами пиролиза хлорированного парафина в ингаляционной камере обнаружили HCl в концентрации 11 400 [10 900; 11 800] ppm и монооксид углерода в концентрации — 1110 [990; 1250] ppm. Содержание кислорода при одновременном нахождении в камере 6 животных снизилось не более чем на 0,6 об. %. При моделировании воздействия Cl2 его концентрация в камере составила 1030 [960; 1070] ppm.

Во время воздействия исследуемых токсикантов у животных наблюдались выраженные признаки раздражающего действия: локомоция с принюхиванием и подъемом на задние лапы, истечение слизи из носа, усиленное слезотечение, сначала — увеличение, а затем снижение двигательной активности вплоть до полной адинамии.

В течение 6 ч после извлечения животных из ингаляционной камеры двигательная активность оставалась сниженной, наблюдалось истечение слизи из полости носа, отек склер, блефарит, неравномерное дыхание со «свистящим» звуком.

Через 1 ч после воздействия токсикантов у животных группы II ЛК увеличился (p < 0,05) почти в 5 раз по сравнению с животными группы I. У животных группы II по сравнению с животными группы III через 1 ч после воздействия ЛК увеличился более чем в 3 раза (p < 0,05). Через 3 и 6 ч после воздействия наблюдалось увеличение ЛК у животных группы III по сравнению с контролем (р < 0,05). Однако величина ЛК в этой группе оставалась в 2–2,5 раза ниже (p < 0,05) по сравнению с животными группы II (рис. 1).

 

Рис. 1. Динамика легочного коэффициента у крыс в различные сроки после интоксикации Cl2 и HCl, (1,5LC50, 30 мин).

Fig. 1. Dynamics of the lung coefficient in rats at different times after Cl2 and HCl intoxication (1.5 LC50, 30 min): * — differences compared to group I; ^ — differences between groups II and III (p < 0.05); in each group, n = 6

 

Увеличение ЛК у животных групп II и III сопровождалось увеличением содержания исследуемых цитокинов. Так, во все исследуемые сроки (через 0,1, 1, 3 и 6 ч после воздействия токсикантов) в БАЛЖ в группе II отмечалось увеличение (p < 0,05) содержания IL-1β по сравнению с группой I. В группе III у животных увеличение содержания IL-1β ((р < 0,05) по сравнению с контролем) наблюдалось через 3 и 6 ч после воздействия, при этом содержание IL-1β оставалось сниженным (р < 0,05) по сравнению животными группы II (рис. 2 а).

 

Рис. 2. Динамика содержания IL-1β (а) и IL-6 (б) в БАЛЖ лабораторных животных в различные сроки после интоксикации Cl2 и HCl, (1,5LC50, 30 мин).

Fig. 2. Dynamics of IL-1β (a) and IL-6 (b) content in the bronchoalveolar lavage fluid of laboratory animals at different times after Cl2 and HCl intoxication (1,5 LC50, 30 min): * — differences compared to group I; ^ — differences between groups II and II (p < 0.05); in each group, n = 6

 

У животных группы II наблюдалось увеличение (p < 0,05) содержания цитокина IL-6 во все исследуемые сроки по сравнению с исследуемыми группами. В то же время у животных группы III увеличение (р < 0,05) содержания IL-6 (по сравнению с контролем) было отмечено только через 6 ч после воздействия (рис. 2 b). Такое отсроченное нарастание содержания IL-1β и IL-6 в тканях легких отражает процесс повышения миграции нейтрофилов из сосудистого русла в очаг воспаления и дальнейшее развитие местной воспалительной реакции [12–15], направленной на лизирование пораженных альвеолоцитов [16].

 

Рис. 3. Динамика содержания IL-10 (в) и IFN-γ (г) в БАЛЖ лабораторных животных в различные сроки после интоксикации Cl2 и HCl, (1,5LC50, 30 мин).

Fig. 3. Dynamics of IL-10 (a) and IFN-γ (b) content in the bronchoalveolar lavage fluid of laboratory animals at different times after Cl2 and HCl intoxication (1,5 LC50, 30 min): * — differences compared to group I; ^ — differences between groups II and III (p < 0.05); in each group, n = 6

 

При анализе содержания IL-10 и IFN-γ выявлена схожая динамика. Так, у животных группы II достоверно увеличивается содержание данных цитокинов во все сроки по сравнению с животными групп I и III. Значимое увеличение содержания IL-10 и IFN-γ у животных группы III по сравнению с контролем наблюдалось только через 6 ч после воздействия (рис. 3). Такое увеличение противовоспалительных цитокинов расценивалось как следствие компенсаторной реакции на возникшую острую воспалительную реакцию.

Увеличение содержания провоспалительных агентов и непосредственное повреждение альвеолоцитов приводит к нарушению функции аэрогематического барьера, выходу жидкости и манифестации токсического отека легких, что подтверждено значимым увеличением ЛК через 3 ч после воздействия HCl.

Заключение

При моделировании токсического отека легких воздействием HCl и Cl2 установлено, что увеличение (p < 0,05) ЛК у животных, подвергшихся интоксикации хлором, начиналось уже через 1 ч после воздействия и сопровождалось увеличением (p < 0,05) содержания цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-10, IFN-γ) в БАЛЖ. В свою очередь достоверное (p < 0,05) нарастание ЛК и содержания цитокинов у животных, подвергшихся воздействию HCl, происходит только через 3 ч после воздействия. Изменения скорости нарастания ЛК и динамика содержания цитокинов в БАЛЖ лабораторных животных позволяют сделать предположение о разной скорости развития и различных механизмах формирования токсического отека легких при воздействии данными пульмонотоксикантами.

×

Об авторах

Петр Кириллович Потапов

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Автор, ответственный за переписку.
Email: Footballprospb@gmail.com
SPIN-код: 5979-4490

Адъюнкт

Россия, Санкт-Петербург

Павел Геннадьевич Толкач

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: Footballprospb@gmail.com
SPIN-код: 4304-1890

кандидат медицинских наук

Россия, Санкт-Петербург

Надежда Юрьевна Роговская

Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России

Email: Footballprospb@gmail.com

Научный сотрудник 

Россия, Санкт-Петербург

Владимир Николаевич Бабаков

Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России

Email: Footballprospb@gmail.com

кандидат биологических наук

Россия, Санкт-Петербург

Вадим Александрович Башарин

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: Footballprospb@gmail.com

доктор медицинских наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Торкунов П.А., Шабанов П.Д. Токсический отек легких: патогенез, моделирование, методология изучения // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2008. Т. 6, № 2. С. 42–54.
  2. White C.W., Martin J.G. Chlorine gas inhalation: human clinical evidence of toxicity and experience in animal models // Proceedings of the American Thoracic Society. 2010. Vol. 7, No. 4. P. 257–263. doi: 10.1513/pats.201001-008SM
  3. Международная статистическая классификация болезней и проблем, связанных со здоровьем; 10-й пересмотр. Женева: ВОЗ. 2004. Т. 1, ч. 1. 698 с.
  4. Barrow C.S., Y. Alarie, J.C. Warrick, et al. Comparison of the sensory irritation response in mice to chlorine and hydrogen chloride // Archives of Environmental Health: An International Journal. 1977. Vol. 32, No. 2. P. 68–76. doi: 10.1080/00039896.1977.10667258
  5. Miller S.N. Acute toxicity of respiratory irritant exposures. The Toxicant Induction of Irritant Asthma, Rhinitis, and Related Conditions. Boston: Springer; 2013. P. 83–101. doi: 10.1007/978-1-4614-9044-9_4
  6. Потапов П.К., Димитриев Ю.В., Толкач П.Г. Cтруктурно-функциональные нарушения дыхательной системы у лабораторных животных при интоксикации продуктами пиролиза хлорсодержащих полимерных материалов // Медицинский академический журнал. 2020. № 3. C. 13–22.
  7. Банадыков К.Д., Лютенко Э.Р., Алибекова А.И., и др. Современные аспекты токсического действия хлора // Тверской медицинский журнал. 2016. № 2. С. 21–22.
  8. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. СПб.: Фолиант, 2008. 552 с
  9. Чучалин А.Г. Биологические маркеры при респираторных заболеваниях // Терапевтический архив. 2014. Т. 86, № 3. С. 4–13.
  10. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях НП объединение специалистов по работе с лабораторными животными. СПб.: Rus-LASA, 2012. 48 с.
  11. Beck G. Etude cyto-bactériologique quantitative de l’expectoration chez le bronchiteux chronique // Revue francaise des maladies respiratoires. 1980. Vol. 8, No. 5. P. 357–366.
  12. Давидюк О.В., Доценко А.М., Косолапов Д.А. Понятие и проведение пробит-анализа при решении задач количественной оценки риска аварий // Безопасность труда в промышленности. 2009. № 4. С. 48–51.
  13. Пугач В.А., Тюнин М.А., Власов Т.Д., и др. Биомаркеры острого респираторного дистресс-синдрома: проблемы и перспективы их применения // Вестник анестезиологии и реаниматологии. 2019. Т. 16, № 4. C. 38–46.
  14. Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж. Роль цитокинов в воспалительном процессе (сообщение 1) // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т. 81, № 6. С. 5–8.
  15. Чучалин А.Г. Отек легких: физиология легочного кровообращения и патофизиология отека легких // Русский медицинский журнал. 2005. № 21. С. 1374–1382. doi: 10.18093/0869-0189-2005-0-4-9-18
  16. Родионов Г.Г., Хурцилава О.Г., Плужников Н.Н., и др. Оксидативный стресс и воспаление: патогенетическое партнерство. СПб.: Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, 2012. 340 c.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Динамика легочного коэффициента у крыс в различные сроки после интоксикации Cl2 и HCl, (1,5LC50, 30 мин).

Скачать (9KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Динамика содержания IL-1β (а) и IL-6 (б) в БАЛЖ лабораторных животных в различные сроки после интоксикации Cl2 и HCl, (1,5LC50, 30 мин).

Скачать (18KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Динамика содержания IL-10 (в) и IFN-γ (г) в БАЛЖ лабораторных животных в различные сроки после интоксикации Cl2 и HCl, (1,5LC50, 30 мин).

Скачать (16KB)
Метаданные

© Потапов П.К., Толкач П.Г., Роговская Н.Ю., Бабаков В.Н., Башарин В.А., 2021

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 77762 от 10.02.2020.