Development of technology for producing essential fatty acids from hydrolysates of high-fat fish

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время существует острая нехватка омега-3 и омега-6 ненасыщенных жирных кислот в суточном рационе жителей большинства европейских стран, поскольку их основные пищевые источники — жирная морская рыба, морепродукты [1] — необычная еда для людей в континентальных странах.

Структурные компоненты липидов предотвращают отложение липопротеинов низкой плотности и холестерина на стенках кровеносных сосудов, предотвращают агрегацию клеток крови и образование тромбов, снимают воспаления и т. д. [2]. В отсутствие этих основных факторов питания возникают тяжелые сердечно-сосудистые заболевания, сердечные приступы, инсульты, а продолжительность жизни населения снижается. Омега-3 также используется при лечении диабета и артрита [3, 4]. Потребление полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), согласно рекомендациям по диетическому питанию, заменяет насыщенные жирные кислоты для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний [5]. Cамыми богатыми источниками омега-3 ПНЖК (омега-3 ЖК) являются жиры из морских рыб, потребление которых увеличивает защиту от сердечно-сосудистых заболеваний [6, 7]. Кроме того, было показано, что омега-3-ЖК из рыбьего жира являются более мощным средством, чем растительные омега-3-ЖК, для ингибирования опухолей молочной железы [8].

Многочисленные исследования показывают, что, помимо самих гидробионтов, большое количество незаменимых жирных кислот также содержится в отходах от их разделки. Поэтому целесообразно использовать их для получения биологически активных добавок (БАД) в виде концентрированных растворов ненасыщенных жирных кислот. Для разработки технологии был изучен биохимический состав лосося и сельди и показана возможность их применения.

Известно, что для получения липидов БАД из жирного рыбного сырья, насыщенного омега-3- и омега-6-ЖК, витаминами и фосфолипидами, имеют преимущества технологии, основанные на гидролизе белковых компонентов сырья с последующим выделением масляных компонентов из белково-липидной эмульсии, например, технология производства концентрата витамина А [9].

Среди существующих технологий гидролиза отходов переработки гидробионтов, а именно кислотно-щелочных, ферментативных и др., была выбрана технология щелочного гидролиза, основанная на синтезе щелочи в процессе электрохимической обработки сырья [10, 11]. Параметры электрохимической обработки были разработаны нами ранее для выделения белка из ракообразных [12, 13]. Технология позволяет сочетать использование нереакционного раствора с непосредственным воздействием постоянного электрического поля на сырье, что обеспечивает быстрое достижение процесса растворения и гидролиза дисперсного сырья при низких концентрациях гидроксильных ионов и сохранения качества питательных веществ. Липиды отделяют от раствора белка путем разделения с использованием стандартного оборудования.

При исследовании жирнокислотного состава выделенных липидов обнаружено присутствие в них большого количества омега-3-ЖК. Особая ценность липидов, выделенных из белковых гидролизатов, связана с тем, что липиды мышечных тканей (в частности, отходы от разделки гидробионтов), в отличие от липидов, содержащихся во внутренних органах гидробионтов, содержат вещества, обладающие высокой биологической ценностью (фосфолипиды, омега-3-, омега-6-ЖК, витамины), тогда как во внутренних органах преобладают триглицериды. Несмотря на трудности в разделении омега-3- и омега-6-ЖК (из-за связи с белками в виде липопротеиновых комплексов), нами проведено исследование по их получению из липидов в качестве целевого продукта в рамках электрохимической технологии переработки сырья [14–17].

Концентрация полученных компонентов жира является многообещающей из-за проблематичного потребления больших количеств (15–20 г в день) традиционных пищевых добавок — рыбного жира, в связи с его жирной и специфической консистенцией [16, 18]. В связи с этим особый интерес вызывает разработка технологии извлечения незаменимых жирных кислот из рыбьего жира, в частности методом криоконцентрирования, который позволяет сохранить качество жира благодаря использованию низкотемпературных режимов, что существенно замедляет процессы окисления.

Цель исследования — разработать технологию получения эссенциальных жирных кислот из гидролизатов рыб повышенной жирности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования для получения белково-жировой эмульсии (гидролизата) выбрано сырье из форели радужной (Oncorhynchus mykiss) и сельди атлантической (Clupea harengus). В качестве образца для криоконцентрирования взят жир, полученный путем отделения из эмульсии. Сырую рыбу получали в охлажденном (форель) и замороженном (сельдь) видах. Форель перевозилась в герметично упакованных пластиковых контейнерах. Хранение осуществлялось в холодильной камере при температуре +5 °С. Замороженная сельдь доставлялась блоками, хранение осуществлялось в морозильной камере при температуре –18 °С.

Для получения белкового гидролизата использовали процесс электрохимической обработки включавший в себя определенные стадии: набухания, экстракция водорастворимых компонентов (альбуминов, углеводов и т. д.) и экстракцию труднорастворимых компонентов (миофибриллярных и других белков, белково-липидных, белково-гликозидных и др. комплексов). Процесс завершается переходом белков, полипептидов, липидов в раствор в виде эмульсии и выпадением в осадок костной или панцирной ткани. Выбранный способ имеет несколько преимуществ:

• высокий выход (95–98%) липидов из сырья;
• проведение одновременно экстракции жира и его рафинирования (за счет обработки в катодной камере электролизера при значениях рН ≥12,2);
• сохранение высокого качества получаемых липидов благодаря щадящим режимам обработки (поскольку они не подвергаются длительному воздействию высоких температур, давления (как в технологии сушки прессованием) или растворителей).

В связи с тем, что жир, выделенный из белковых растворов, характеризуется высокими значениями рН, необходима стадия его нейтрализации. Первой стадией гидратации является промывание 10% раствором поваренной соли и горячей водой (температура +90–100 °C) в соотношении 1:1 до полного удаления щелочи и поверхностно-активных веществ. Количество промывок варьируется от 3 до 5. Каждая промывка завершается перемешиванием массы в течение 10–15 мин, отстаиванием в течение 1–2 ч и сливанием нижней части отстоя. Верхняя часть промывается снова. Для удаления оставшейся влаги промытый жир сушат при температуре около +140 °С и вакууме не менее 79,98 кПа при непрерывной работе мешалки. После сушки жир не должен содержать более 0,6% влаги. Затем жир отправляют на сепарирование.

Физико-химические свойства сырья и полученных липидов определяли по ГОСТ 7636-85 [19], а именно, содержание влаги и золы для рыбного сырья, йодное и кислотное число для липидов.

Состав жирных кислот исследовали методом газовой хроматографии (с предварительным метилированием образцов). Полученные образцы рыбьего жира исследовали хроматографическим методом [20]. Анализ качественного состава рыбьего жира проводился на газовом хроматографическом масс-спектрометре GCMS-TQ8040 фирмы Shimadzu (Япония)). Сбор и обработка данных осуществлялись с использованием программного обеспечения указанного прибора. При установлении калибровочных характеристик и проведении измерений массы фракции жирных кислот определенных условий не наблюдалось.

Фракционное деление липидов осуществлялось путем криоконцентрирования. Для этого рыбий жир охлаждали в стеклянных пробирках объемом 50 мл, помещенных в емкость с 28% раствором хлористого кальция, охлаждаемого низкотемпературной холодильной установкой. Температура измерялась внутри образца и в охлаждающей среде с помощью электронных термометров марки Vapan (Россия). После фиксирования фазовых переходов в жире при температурах +4, –6, –14 и –37 °С жир смешивали с ацетоном в соотношении 1:8 и затем повторяли охлаждение от +20 до –40 °С. После каждого фазового перехода жир разделяли на твердую и жидкую фракции фильтрованием.

Достоверность данных была достигнута путем планирования количества экспериментов, необходимых и достаточных для достижения уровня достоверности при р < 0,05. Статистическая обработка данных проводилась с использованием стандартных методов оценки результатов испытаний для небольших выборок с использованием Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corp., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что отходы от разделки сельди атлантической и форели радужной, как и сами рыбы, характеризуются ценным химическим составом, высоким содержанием жира (табл. 1), что указывает на целесообразность использования их как сырьевого источника для получения биологически-активного вещества (БАВ) липоидной природы.

 

Таблица 1. Химический состав отходов от разделки сельди атлантической и форели радужной, %

Table 1. Chemical composition of waste from cutting Atlantic herring and rainbow trout, %

Часть тела	Влага	Жир	Белок	Зола	Энергетическая ценность, ккал
Сельдь атлантическая
Мясо с кожей	69,0 ± 0,70	7,3 ± 0,39	22,6 ± 0,37	1,8 ± 0,03	161
Кости	58,6 ± 0,89	10,6 ± 0,33	18,8 ± 0,27	9,2 ± 0,38	175,7
Плавники	65,4 ± 0,95	9,4 ± 0,37	16,7 ± 0,31	10,0 ± 0,21	156
Голова	69,5 ± 0,98	9,7 ± 0,08	13,2 ± 0,20	4,7 ± 0,40	139
Форель радужная
Мясо с кожей	71,3 ± 0,92	5,3 ± 0,26	22,0 ± 0,88	1,5 ± 0,10	139
Кости	62,4 ± 1,13	11,04 ± 0,72	18,2 ± 0,70	9 ± 0,40	176
Плавники	66,4 ± 0,53	6,6 ± 0,44	16,9 ± 0,70	9,75 ± 0,76	130,7
Голова	70,8 ± 0,64	10,2 ± 0,70	14,8 ± 0,40	3,4 ± 0,28	156

Примечание: различия между образцами сельди и форели статистически значимы, р < 0,05.

 

Существенных различий в биохимическом составе кожи, костей, плавников и голов сельди атлантической и форели радужной не выявлено. Поэтому для извлечения жира и других пищевых добавок можно использовать все отходы, перечисленные в табл. 1.

Для получения БАВ, насыщенных омега-3 и омега-6-кислотами, витаминами и фосфолипидами, из жирного рыбного сырья была выбрана технология, основанная на электрохимическом гидролизе белковых компонентов сырья с последующим выделением из белково-липидной эмульсии жировых компонентов [13].

Электрохимический способ воздействия на биологическое сырье включает прямое воздействие электрического поля на сырье и водную среду, что позволяет осуществлять точный контроль процессов, упрощает их автоматизацию, а также снижает энергетические затраты. При обработке сырья в электрическом поле ускоряются процессы диффузии и экстракции, увеличивается интенсивность и глубина протекания химических и физических процессов. Благодаря этому происходит интенсификация переработки сырья.

Для электрохимической обработки использовали электролизеры с плоскопараллельным расположением электродов, разделенных ионоселективной мембраной. Были выбраны оптимальные параметры обработки дисперсного сырья, что обеспечило полное растворение фракции белка: ток, напряжение, время обработки суспензии в электролизере, время нагрева суспензии после электролизера в реакторе с мешалкой. Нерастворимый костный остаток отделяли центрифугированием. Липиды из раствора белка выделяли методом сепарирования.

Технологическая схема комплексной переработки отходов (колтычки, плавники, кости, чешуя, кожа) от разделки лососевых рыб электрохимическим способом с получением липидов из белковых растворов представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Технологическая схема комплексной переработки отходов от разделки рыб электрохимическим способом с получением липидов из белковых растворов

Fig. 1. Technological scheme of complex processing of waste from fish cutting by electrochemical method with the production of lipids from protein solutions

 

Выход жира из отходов от разделки форели и сельди при их переработке электрохимическим способом составил 7 и 8% соответственно, что приближается к 90% от теоретического. Данная технология была разработана с целью максимального сохранения качества БАВ липоидной природы благодаря щадящим условиям воздействия на сырье в процессе экстрагирования. Так как существующие технологии, основанные на использовании органических растворителей, высоких температур, химических реагентов, отличаются «жесткостью» воздействия на сырье, это приводит к окислительной порче БАВ из липидов и белков.

Установлено, что рыбий жир, полученный электрохимическим способом из отходов форели и сельди (табл. 2), содержит значительное количество омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (около 30% от суммы жирных кислот), но в количествах, недостаточных для удовлетворения суточной потребности человека (согласно методическим рекомендациям (МР) 2.3.1.2432–08) [21], поэтому необходимо было разработать технологию их концентрирования, так как в работе стояла задача получить рыбий жир с повышенным содержанием омега-3-кислот для последующего капсулирования.

 

Таблица 2. Жирнокислотный состав жира образцов сельди и форели, % от суммы жирных кислот

Table 2. Fatty acid composition of herring and trout samples, % of total fatty acids

Жирная кислота	Индекс жирной кислоты	Средняя проба сельди	Жир из белкового гидролизата сельди	Средняя проба форели
Каприновая	10:0	0,12	0,02	0,02
Лауриновая	12:0	0,28	0,58	0,25
Миристиновая	14:0	2,18	5,98	1,15
Миристолеиновая	14:1	0,06	0,06	0,07
Изо-пентадекановая	15:0i	0,05	0,16	0,20
Антеизо-пентадекановая	15:0ai	0,05	0,05	0,09
Пентадекановая	15:0	0,26	0,31	0,42
Пентадеценовая	15:1	0,05	0,08	0,04
Пальмитиновая	16:0	13,48	10,65	13,15
Гексадеценовая	16:1	0,14	0,12	0,23
Пальмитолеиновая	16:1 9-цис	2,55	4,31	3,43
Маргариновая	17:0	0,22	0,40	0,62
Гептадеценовая	17:1	0,40	0,29	0,49
Стеариновая	18:0	4,1	3,81	4,84
Элаидиновая	18:1 9-транс	0,88	0,81	1,13
Олеиновая	18:1 9-цис	16,80	18,33	20,12
Вакценовая	18:1 11-транс	2,01	1,59	2,05
Октадеценовая	18:1 11-цис	0,09	0,22	0,14
Линолевая	18:2 ω-6	3,59	1,08	1,97
Линоленовая	18:3 ω-6	0,17	0,12	0,06
α-линоленовая	18:3 ω-3	5,80	0,86	0,67
Арахиновая	20:0	0,11	0,16	0,21
Гондоиновая	20:1	6,90	14,31	10,83
Эйкозадиеновая	20:2	0,33	0,39	0,51
Эйкозатриеновая	20:3 8, 11, 14-транс	0,21	0,15	0,23
Арахидоновая	20:4 ω-6	0,87	0,41	1,08
Эйкозапентаеновая	20:5 ω-3	6,25	2,3	5,45
Бегеновая	22:0	0,07	0,06	0,07
Эруковая	22:1	5,99	15,99	11,23
Докозадиеновая	22:2	0,05	0,09	0,13
Докозапентаеновая	22:5 ω-6	3,66	3,71	3,54
Докозагексаеновая	22:6 ω-3	22,30	7,81	12,03
Лигноцериновая	24:0	0,04	0,10	0,04
Нервоновая	24:1	0,78	0,77	1,24

 

Жир из вторичного рыбного сырья фильтровали до получения прозрачной тягучей массы без включений и хранили при +4 °C. Для концентрирования жира, содержащего омега-3-ЖК, объект исследования охлаждали. Жир помещался в стеклянные пробирки. Процесс охлаждения жира в пробирках проводился на установке, представляющей собой емкость с раствором хлористого кальция, охлаждаемого низкотемпературной холодильной установкой. Средняя скорость охлаждения и замораживания — 0,3 °C/с. Температура фиксировалась внутри образца и в охлаждающей среде термопарами [22, 23].

Установлено, что фазовые переходы в жире интенсивно происходят при температурах: минус 6, 14 и 37 °С. Фазовые переходы сопровождаются выпадением в осадок менее насыщенных двойными связями фракций липидов. После центрифугирования надосадочную фракцию липидов, обогащенную ненасыщенными жирными кислотами, подвергали дальнейшему охлаждению. На рис. 2 представлены фотоснимки выделившихся при криоконцентрировании фракций.

 

Рис. 2. Жировые фракции, полученные при криоконцентрировании БАВ липоидной природы из вторичного рыбного сырья: 1 – образец жира при +4 °С; 2 — жидкая жировая фракция, отделенная от образца 1 при –6 °С; 3 — жидкая жировая фракция, выделенная из образца 2 при –14 °С; 4 — жидкая жировая фракция, выделенная из образца 3 при –37 °С

Fig. 2. Fat fractions obtained by cryoconcentration of lipoid BAS from secondary fish raw materials: 1 — fat sample at +4 °C; 2 — liquid fat fraction separated from sample 1 at –6 °C; 3 — liquid fat fraction isolated from sample 2 at –14 °C; 4 — liquid fat fraction isolated from sample 3 at –37 °C

 

Эксперимент по охлаждению и замораживанию повторяли, смешивая жир с ацетоном в соотношении 1:8, чтобы обеспечить количественное разделение фракций во время замораживания.

В ходе эксперимента охлаждения БАВ липоидной природы из вторичного рыбного сырья была получена кривая зависимости температуры от времени (рис. 3), где наблюдались участки фазовых переходов и разделения фракций, что соответствует данным патента РФ № 2031923 [17].

 

Рис. 3. Зависимость фазовых переходов рыбьего жира от температуры и времени охлаждения и замораживания

Fig. 3. Dependence of phase transitions of fish oil on temperature and time of cooling and freezing

 

Измерения температуры проводились термометром Vapan со стандартным отклонением 0,14. После каждого фазового перехода осуществлялось отделение выпавшего осадка липоидов и их количественное определение. Результаты фракционного анализа представлены в табл. 3 и на рис. 4.

 

Рис. 4. Фракционный состав биологически активных веществ липоидной природы, полученный из отходов от разделки форели радужной

Fig. 4. Fractional composition of biologically active substances of lipoid nature obtained from waste from cutting rainbow trout

 

Таблица 3. Зависимость выхода твердой фракции биологически активных веществ липоидной природы из вторичного рыбного сырья от температуры

Table 3. Dependence of the yield of the solid fraction of biologically active substances of lipoid nature from secondary fish raw materials on temperature

Температура, оС		+4	–14	–37
Отделившаяся фракция, %	Опыт 1	6,0	92,5	55,2
	Опыт 2	5,1	93,0	56,0

 

Используя процесс криоконцентрирования удалось повысить содержание фракций жира, включающих омега-3-ЖК ориентировочно в 3 раза (табл. 4).

 

Таблица 4. Биохимические свойства криоконцентрированного жира, выделенного из гидролизата отходов от разделки форели радужной

Table 4. Biochemical properties of cryoconcentrated fat isolated from hydrolysate of waste from cutting rainbow trout

Показатель	БАВ при t +4 °С	БАВ при t –14 °С	Осадок при t –14 °С	БАВ при t –37 °С
Кислотное число, мг KOH/г	1,6	1,7	2,3	2,5
Йодное число, г/100 г	109,03	298,29	207,52	341,38
Эйкозапентаеновая кислота, % в жире	0,75	10,00	–	31,3
Докозагексаеновая кислота, % в жире	1,80	24,07	–	62,7

 

По данным МР 2.3.1.2432-08, суточная потребность в омега-3-ЖК составляет в среднем 7,3 г/сут. Расчет осуществлялся с учетом того, что суточная потребность должна соответствовать 1–2% от суточной калорийности рациона (например, 2400 ккал для II группы населения, включающей людей до 30 лет с коэффициентом активности 1,6). Учитывая, что сельдь атлантическая, отобранная для исследования, содержит 1,64 г /100 г рыбы омега-3, а форель содержит 0,97 г / 100 г, для удовлетворения суточной потребности в омега-3-ЖК, продукты из сельди и форели нуждаются в дополнительном обогащении этими кислотами, что достигается введением в них 22 г рыбьего жира в составе функционального пищевого продукта.

Однако технологически затруднительно ввести такое количество липидов в функциональные продукты питания (ФПП), особенно для продуктов не на фаршевой основе. Этот недостаток позволяет устранить разработанная технология криоконцентрирования липидов. С учетом того, что при криоконцентрировании концентрация омега-3-ЖК увеличивается в 3 раза, достаточно введения 6 г жира на 100 г продукта из сельди и 6,6 г жира на 100 г продукта из форели для удовлетворения суточной нормы потребления омега-3-ЖК. Для удовлетворения 30% от суточной нормы потребления омега-3-ЖК необходимое количество вводимого криоконцентрированного жира составляет до 1,8 и 1,98 г соответственно, что технологически легко реализуемо.

По данным Всемирной организации здравоохранения [24], пищевой продукт относится к группе ФПП, если его потребляемая порция (100 г) обеспечивает на 30% суточную норму потребления целевого компонента.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения БАВ липоидной природы, обогащенных омега-3-ЖК, из отходов от переработки гидробионтов путем электрохимического гидролиза и криоконцентрирования. Проведен сравнительный анализ состава отходов от разделки сельди и форели, показана целесообразность их использования для получения БАВ липоидной природы.
2. Создана технологическая схема и определены выходы жира при его получении из отходов рыб электрохимическим способом. Определен жирнокислотный состав жира, полученного электрохимическим способом.
3. Криоконцентрированный жир, полученный из отходов от разделки форели и сельди электрохимическим способом, обладает существенно повышенным содержанием омега-3-ЖК и, соответственно, биологической ценностью по сравнению с пищевым и медицинским рыбным жиром из печени семейства тресковых.
4. Для удовлетворения 30% от рекомендуемой суточной нормы потребления омега-3-ЖК при разработке функциональных пищевых продуктов на основе форели радужной и сельди атлантической необходимо ввести 1,98 г и 1,8 г криоконцентрированного рыбьего жира. После инкапсулирования в нанокапсулы препарат станет пригодным для обогащения омега-3-ЖК любых пищевых продуктов, что является предметом дальнейших исследований.

About the authors

Elena E. Kuprina

National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics (ITMO)

Author for correspondence.
Email: elkuprina@yandex.ru

doctor of technical sciences, professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Evgeniya S. Grishina

National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics (ITMO)

Email: grishinas@yandex.ru

master’s student

Russian Federation, Saint Petersburg

Anastasia N. Yakkola

National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics (ITMO)

Email: shokoladnitsa@list.ru

postgraduate student

Russian Federation, Saint Petersburg

Andrey N. Manuilov

National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics (ITMO)

Email: manu2@mail.ru

postgraduate student

Russian Federation, Saint Petersburg

Pavel I. Demidov

National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics (ITMO)

Email: pademido@mail.ru

postgraduate student

Russian Federation, Saint Petersburg

Yulia G. Ivnenko

National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics (ITMO)

Email: tehnojul@mail.ru

master’s student

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files