Isolation of biologically active substances from plant objects in military field technology by the example of Urtica dioica L.

Full Text

Введение. Роль фитотерапии в военном здравоохранении сложно переоценить. В ситуациях, когда запасы лекарственных средств и изделий медицинского назначения исчерпаны или недоступны, использование природных источников с целью терапии и профилактики заболеваний является оправданным. В годы Великой Отечественной войны сбор лекарственных растений для этих целей было делом оборонного значения [6]. Изучение свойств, строения и методов выделения биологически активных веществ (БАВ) из растительных объектов с целью оценки их дальнейшего применения в полевых условиях военного времени легли в основу особого научного направления – военно-полевой технологии и контроля качества лекарственных средств. Основной задачей военно-полевой технологии является подбор перспективных растительных объектов и соотнесение их фармакологических эффектов с терапией патологических состояний и заболеваний, преобладающих в военное время. Так, кровотечения и кровопотери являются наиболее распространёнными боевыми патологиями, для лечения которых целесообразно применять фитопрепараты из лекарственного растительного сырья (ЛРС), способствующего увеличению свертываемости крови, стимулирующего гемопоэз, а на этапе восстановления целесообразно использовать витамин-содержащее ЛРС. Настой крапивы двудомной традиционно использовался для этих целей в медицине. Однако выделение БАВ из крапивы двудомной в аспекте военно-полевой технологии лекарств ранее не проводилось.

Следует отметить, что в контексте реализации Федеральной целевой программы «Развитие медицинской и фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2020 и дальнейшую перспективу» создание новых лекарственных препаратов на основе БАВ природного происхождения является актуальной задачей отечественного здравоохранения [8]. Реализация этих задач, а также современное состояние аналитических методов обусловливают более детальное изучение уже известных и широко применяемых растительных объектов, как, например, крапивы двудомной [2, 7, 9].

Лист крапивы является богатым источником витамина С, витамина К, а также каротиноидов. Содержание витамина К, предопределяющего кровоостанавливающие и гемопоэтические свойства растения, по данным разных авторов, составляет до 0,044%. В то же время суммарное содержание каротиноидов, в частности лютеина, неоксантина, виолаксантина, β-каротина, ликопина, в этом виде сырья в некоторых случаях превышает 0,05% [2]. Доминирующим соединением каротиноидной природы является лютеин, относящийся к группе кислородсодержащих каротиноидов – ксантофиллам [3, 5, 6]. Каротиноиды и хлорофиллы являются неотъемлемыми участниками процесса фотосинтеза [5, 11]. Принимая во внимание этот факт, получение индивидуальных каротиноидов из природных источников с высокой степенью чистоты обязательно должно включать этап разделения этих групп БАВ. Разработка унифицированной технологии получения индивидуальных БАВ, в том числе каротиноидов, из растительных объектов могло бы вывести на качественно новый уровень военно-полевую технологию лекарственных средств в качестве особого научного направления военного здравоохранения.

Цель исследования. Разработать способ выделения БАВ из листьев крапивы двудомной.

Гипотеза исследования. Последовательная экстракция порции сырья растворителями с различной, а в некоторых случаях, специфической элюирующей способностью в отношении различных классов БАВ позволит получить каждую последующую фракцию, «не отягощенную» балластными веществами.

Материалы и методы. В качестве объектов исследования выбраны две промышленные серии лекарственного сырья отечественных производителей (Закрытое акционерное общество фирма «Здоровье», серия 081214; Общество с ограниченной ответственностью производственно-коммерческая фирма «Фитофарм», серия 040914) и ЛРС, собранное в окрестностях г. Пятигорска в июне 2015 г., которому присвоен номер серии 110615.

Определение внешнего вида, влажности сырья, золы общей и золы, нерастворимой в хлористоводородной кислоте, анализ методом ультрафиолетовой спектрофотометрии проводили в соответствии с Государственной фармакопей XIII. При этом содержание экстрактивных веществ было определено согласно методу 3 общей фармакопейной статьи «Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» ГФ XIII [1].

Модельный экстракт, содержащий суммарную фракцию каротиноидов и хлорофиллов, получали методом ремацерации: шрот, предварительно обработанный водой очищенной и спиртом этиловым 40 и 70%, заливали 6 частями экстрагента. В качестве экстрагента были исследованы 95% этилового спирта, ацетон и хлороформ, которые брали из расчета 1:10 (коэффициент поглощения сырья – 1,8). Настаивали в течение 2, 4, 6 и 7 суток с 6 объемами экстрагента, экстрагент сливали. Далее сырье заливали 2 объемами одноименного эктрагента, время экстракции – 24 ч, экстрагент сливали. Затем шрот повторно заливали 2 объемами экстрагента, время экстракции – 24 ч, экстрагент сливали. Экстракты объединяли, упаривали до объема 1 мл и подвергали разделению пигментов.

Объединенный экстракт, содержащий каротиноиды и хлорофилы, анализировали спектрофотометрически по следующей методике: 5 мл экстракта помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объем раствора до метки или 95% этилового спирта, или ацетоном, или хлороформом, раствор перемешивали (раствор А).

5 мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора до метки тем же растворителем (раствор Б).

Измеряли спектр поглощения растворов Б в интервале длин волн от 200 до 750 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм, раствор сравнения – 95% этилового спирта (или ацетон или хлороформ).

Для количественных расчетов в качестве аналитической использовали длину волны при 445 нм (95% этилового спирта), 443 нм (ацетон), 458 нм (хлороформ). Параллельно в тех же условиях измеряли оптическую плотность стандартного образца (СО) лютеина (127-40-2 Sigma-Aldrich).

Приготовление раствора СО лютеина. Точную навеску СО лютеина, равную 0,10000 г, помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 50 мл 95% этилового спирта (или хлороформа, или ацетона) доводили объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А).

1 мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили объем раствора до метки тем же растворителем (раствор Б).

5 мл раствора Б переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили объем раствора до метки тем же растворителем (раствор В).

Содержание каротиноидов в сырье в пересчете на стандартный образец лютеина в процентах расчитывали по формуле:

 

$X=\frac{A_x\times 50\times 100\times {\alpha }_{ст}\times 1\times 5\times 100}{a_x\times 5\times A_{ст}\times 100\times 100\times 50}\times \frac{100}{\left(100-W\right)}$

 

Расчет содержания каротиноидов и хлорофиллов при совместном присутствии проводили в соответствии с литературными данными [7, 9–11].

Разделение каротиноидов и хлорофиллов проводили методом жидкостной экстракции, используя экстрагенты различной полярности, в частности петролейный эфир и 95% этилового спирта.

Результаты и их обсуждение. Для получения достоверных экспериментальных данных необходимо было установить соответствие исходного сырья требованиям ГФ XIII, которое было проанализировано по следующим показателям: внешний вид, влажность (не более 13%), зола общая (не более 20%), зола, нерастворимая в кислоте хлористоводородной (не более 2%). Все три серии лекарственного растительного сырья соответствовали требованиям ГФ ХIII. Так как в дальнейшей работе использовали экстракционные методы, то было определено содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой очищенной – 40, 70 и 95% этилового спирта [1].

В связи с тем, что в ходе эксперимента необходимо было получить модельный экстракт, содержащий каротиноиды и хлорофиллы, провели количественное определение этих соединений в исходном сырье методом спектрофотометрии, используя в качестве экстрагентов 95% этилового спирта и ацетон с содержанием 20% воды [9, 10, 12] (табл. 1, 2).

 

Таблица 1

Содержание каротиноидов в исходном сырье*

Номер серии	Содержание суммы каротиноидов, %
	$\overline{x}$	$S\overline{x}$	$∆x$	ε%
081214	0,03459	0,00024	0,00061	1,78
040914	0,03523	0,00033	0,00084	2,38
110615	0,03481	0,00037	0,00095	2,74

Примечание: * – данные получены для шести параллельных определений, обработанных статистически, р=0,95.

 

Таблица 2

Содержание хлорофиллов в исходном сырье*, %

Номер серии	$\overline{x}$	$S\overline{x}$	$∆x$	ε%
081214	0,36012	0,000423	0,001088	2,99
040914	0,36861	0,000426	0,001094	3,00
110615	0,35007	0,000478	0,001228	3,40

Примечание: * – данные получены для шести параллельных определений, обработанных статистически, р=0,95.

 

Из таблиц 1 и 2 следует, что среднее значение содержания суммы каротиноидов в листьях крапивы составляет около 0,0349%, хлорофиллов – 0,3601%, что согласуется с данными, ранее опубликованными другими авторами [2, 5, 7].

Видвинутая нами гипотеза легла в основу теоретической схемы получения модельного экстракта из листьев крапивы двудомной, содержащего каротиноиды и хлорофиллы, представленной на рисунке 1. Достичь абсолютной специфичности растворителей в отношении каждого класса БАВ априори невозможно, однако частичную очистку сырья на каждом последующем этапе осуществить можно.

 

Рис. 1. Теоретическая схема получения модельного экстракта из листьев крапивы двудомной, содержащего каротиноиды и хлорофиллы

 

Нами предложено последовательное использование растворителей в порядке уменьшения их полярности. Дальнейшее подтверждение правильности сделанных предположений было проверено экспериментально.

Выбор условий получения суммарного экстракта включал анализ экстрагирующей способности каждого из экстрагентов, контроль динамики экстракции и установление времени контакта фаз на каждом этапе. Необходимость обработки исходного сырья раствором гидрокарбоната натрия была экспериментально подтверждена ранее [4]. По результатам эксперимента была исключена стадия настаивания с водой очищенной, так как профили спектров поглощения водной вытяжки и вытяжки, полученной с 40% этиловым спиртом, в ультрафиолетовой области идентичны. Как показал результат эксперимента, 70% этиловый спирт очищает шрот для последующей экстракции малополярными растворителями, являясь оптимальным экстрагентом для флавоноидов, извлекая этот класс БАВ. Далее в соответствии с предложенной схемой были использованы растворители, которые наиболее эффективно экстрагируют каротиноиды из любых объектов – 95% этиловый спирт, ацетон, хлороформ. В ходе получения экстрактов дополнительно изучали динамику экстрагирования. Электронные спектры поглощения экстрактов имели максимумы поглощения в интервале длин волн от 360 до 450 нм и около 660–670 нм, что подтверждает содержание в них суммы каротиноидов и хлорофиллов (рис. 2).

 

Рис. 2. Динамика экстракции липофильной фракции, содержащей каротиноиды и хлорофиллы: 1 – на 2-е сутки; 2 – на 4-е сутки; 3 –на 6-е сутки, 4 – на 7-е сутки; экстрагент: а – ацетон; б – 95% этиловый спирт; в – хлороформ

 

Таким образом, для дальнейшей работы были получены модельные экстракты, содержащие каротиноиды и хлорофиллы. Экспериментально установлены оптимальные условия получения модельного экстракта: экстрагенты, последовательно используемые для получения «очищенного шрота», – 40% этиловый спирт, 70% этиловый спирт; время экстракции на каждом этапе очистки шрота – по 24 ч; экстрагенты для получения модельного экстракта – 95% этиловый спирт, ацетон, хлороформ; метод экстракции – ремацерация; гидромодуль – 1:10.

Для дальнейшего успешного разделения каротиноидов и хлорофиллов и оценки результатов было определено среднее содержание каротиноидов в полученных экстрактах в пересчете на виолаксантин – около 0,0276%, в пересчете на СО лютеина – около 0,0306% и хлорофиллов – около 0,304%. Полученные данные свидетельствуют об эффективности экстракции на уровне 79%.

На следующем этапе исследования теоретически был разработан алгоритм разделения изучаемых пигментов на каротины, ксантофиллы и хлорофиллы, представленный на рисунке 3. При этом учитывались физико-химические свойства этих групп БАВ, растворителей, которые могли бы быть использованы, и способность хлорофиллов подвергаться омылению под действием гидроксида натрия с образованием более полярных, а следовательно, гидрофильных продуктов [3, 5].

 

Рис. 3. Схема разделения каротинов, ксантофиллов и хлорофиллов: *ПЭ – петролейный эфир; **СЭ – спирт этиловый

 

Учитывая, что хлорофиллы и ксантофиллы являются более полярными соединениями, чем каротины, и способны экстрагироваться 95% этиловым спиртом, а петролейный эфир является универсальным растворителем для липофильных соединений, упаренные экстракты растворяли в петролейном эфире и прибавляли 25 мл 95% этиловым спиртом. Для четкого разделения органических слоев в систему добавляли 2,5 мл воды очищенной. После экстракции верхний слой содержал каротины и хлорофиллы, нижний слой ксантофиллы и хлорофиллы. Далее нижний слой переносили в другую делительную воронку.

Фракцию каротинов и хлорофиллов в петролейном эфире обрабатывали раствором натрия гидроксида. Омыленные хлорофиллы экстрагировали этиловым спиртом. Петролейная фракция содержала каротины.

Спиртовую фракцию, содержащую ксантофиллы и хлорофиллы, обрабатывали петролейным эфиром. В результате хлорофиллы концентрировались в петролейном эфире, а ксантофиллы как более полярные соединения экстрагировались этиловым спиртом.

Измерение спектра поглощения объединенной спиртовой фракции после разделения ксантофиллов и хлорофиллов показало, что его профиль характерен для ксантофиллов. Наличие трех максимумов поглощения при 422, 445 и 474 нм и сравнение со спектром СО лютеина подтвердило, что в спиртовой фазе преимущественно содержался лютеин.

Спектр поглощения суммарной каротиновой фракции в петролейном эфире имел профиль, характерный для каротинов с положением максимумов поглощения при 426 нм, 451 нм, 478 нм. Количественное определение каротинов показало их содержание на уровне 0,00841%, среднее значение содержания ксантофиллов в пересчете на лютеин составило 0,02090%.

Заключение. Изучение условий получения суммарной липофильной фракции, содержащей сумму каротиноидов и хлорофиллы, и экспериментальный выбор условий разделения этих соединений в целом подтвердили правильность изначально предложенного алгоритма и позволили скорректировать некоторые первичные теоретические позиции. В частности, целесообразно исключить стадию настаивания с водой очищенной и оставить стадию настаивания сырья с 40% этиловым спиртом в связи с практически полной идентичностью экстрагируемых соединений. При этом настаивание исходного сырья с растворителями в порядке уменьшения их полярности дало возможность получить суммарный экстракт, содержащий только каротиноиды и хлорофиллы.

На основании вышеизложенного экспериментального материала предложен способ разделения таких растительных пигментов, как каротиноиды и хлорофиллы, методом жидкостной экстракции. Предложенная схема позволила провести изолирование каротинов и ксантофиллов. Разработанный подход апробирован на трех сериях сырья, соответствовавших требованиям ГФ XIII.

Предложенный способ выделения биологически активных веществ крапивы двудомной может рассматриваться в качестве примера для дальнейшего внедрения в военно-полевую технологию лекарственных средств.

About the authors

E. F. Stepanova

Пятигорский медико-фармацевтический институт

Author for correspondence.
Email: EFStepanova@yandex.ru
Russian Federation, Пятигорск

A. G. Kuregyan

Пятигорский медико-фармацевтический институт

Email: EFStepanova@yandex.ru
Russian Federation, Пятигорск

S. V. Pechinsky

Пятигорский медико-фармацевтический институт

Email: EFStepanova@yandex.ru
Russian Federation, Пятигорск

Yu. Y. Zhidkova

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: EFStepanova@yandex.ru
Russian Federation, Санкт-Петербург

References

Supplementary files