Изменение параметров иммунитета и апоптоза у животных с карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии (43,5°С)

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Анализируется динамика изменения параметров иммунитета и апоптоза у животных с карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии (43,5°С). Установлено, что особенности иммуномодулирующего и апоптозстимулирующего действия гипертермии (43,5°С) на животных – опухоленосителей заключаются в следующем: эффект гипертермии проявляется ростом количества лимфоцитов (СD3+, СD4+, CD8+ и СD20+) на 7-е сутки и снижением к 14-м суткам эксперимента. На фоне временного повышения лимфоцитов Тh 1-го типа отмечается более стойкое увеличение содержания интерферона-γ, что является отражением активности клеточных иммунных реакций организма в ответ на гипертермию. Кроме того, обнаружено повышение уровней экспрессии проапоптотических белков Bad, Bax и снижение уровня экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 в постгипертермическом периоде. Так, показатели экспрессии белка Bad в клетках карциносаркомы Walker 256 на 7-е и 14-е сутки постгипертермического периода стали достоверно (p<0,05) выше соответственно в 2,05 и 2,15 раза по сравнению с исходным состоянием. Экспрессия уровня белка Вах была также выше соответствующего показателя до сеанса гипертермии (43,5°С), на 7-е и 14-е сутки в 3,52 и 1,69 раза соответственно (p<0,05). Полагаем, что гипертермия как методика, не связанная с прямым термическим повреждением опухолевой ткани, способна оказывать иммуномодулирующий и апоптозстимулирующий эффекты.

Полный текст

Введение. Современные методы терапии злокачественных опухолевых заболеваний не всегда достигают должного результата [5]. Поэтому все большее внимание приобретают альтернативные способы воздействия на злокачественный клеточный рост. Одним из таких способов регуляции активности опухолевого процесса может являться гипертермия. Ее использование в лечении опухолевых заболеваний в последнее время вызывает повышенный интерес в силу своей эффективности и общедоступности [4].

Известно, что злокачественные опухоли обладают иммунодепрессивным эффектом на иммунологическую реактивность организма, преодолеть который методами традиционной терапии не всегда возможно. Устойчивая противоопухолевая протекция достигается за счет индукции как CD8+ Т-клеточного, так и гуморального ответа [9]. Показано, что интерферонγ (IFN-γ) является важным цитокином, ответственным за развитие клеточных иммунных реакций, его уровни в крови имеют большое значение при оценке иммунного статуса при канцерогенезе. [13].
Показано, что процессы гиперплазии регулируются факторами роста и апоптозом. Механизм запуска последнего в гиперплазированной ткани может осуществляться через CD95-рецептор [17]. Считается, что апоптоз принадлежит к одному из механизмов гибели злокачественных клеток, и что его модуляция может изменять резистентность опухоли к терапии [1]. Поэтому важной задачей в этих условиях является поиск путей направленной коррекции иммунитета и стимуляции апоптоза опухолевых клеток. Показано, что гипертермия способна индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, а также значительно усиливать противоопухолевое действие химиотерапевтических средств [15]. Имеются данные об иммуномодулирующих свойствах гипертермии [12], в связи с чем целесообразно исследовать характер перестройки иммунной системы и активности апоптоза у животных – опухоленосителей при воздействии общей гипертермии.

Цель исследования. Изучить особенности изменения параметров иммунитета и апоптоза у крыс с карциносаркомой Walker 256 после сеанса общей гипертермии (43,5°С).

Материалы и методы . Исследования проведены на 75 крысах-самцах линии Wistar массой 180–200 г и возрастом 2,5 мес. Работа с животными выполнялась согласно директивам Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской де кларации. Для экспериментального опухолевого роста использовали перевиваемый штамм карциносаркомы Walker 256, поддерживаемый in vivo в лаборатории физиологической генетики Научноисследовательского института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (Новосибирск). Суспензию клеток Walker 256 вводили крысам в мышцу бедра (106 клеток в 0,1 мл 0,9% раствора NaCl). Через 5 суток после перевивки опухоли, когда ее объем достигал 2,5±0,5 см3, животных подвергали воздействию ОГ.
Способ моделирования искусственной ОГ у мелких лабораторных животных [3] основывался на разогревании крысы в резервуаре универсального водного термостата «BWT-U», предназначенного для точного поддержания установленной температуры в диапазоне от 25°С до 100°С. Уровень ОГ, при котором прекращали разогрев животных, определялся ректальной температурой 43,5°С (стадия теплового удара). Время разогревания животного было индивидуальным, не зависело от исходной температуры тела, массы и составляло не более 17 мин. Забор крови для исследования параметров иммунитета и апоптоза выполнялся перед ОГ (исходное состоянте), а также на 7-е и 14-е сутки после сеанса ОГ.
Иммунологическое исследование проводилось путем определения моноклональных антител (МАТ) к СD3, СD4, СD8, CD16 и СD20 антигенам (LifeSpan BioSciences и MyBioSource, Inc.) в реакции иммунной флюоресценции с учетом результатов на люминесцентном микроскопе «AXIO SCOPE A1 LED» фирмы «Carl Zeiss» (Германия). Концентрацию IFN-γ в сыворотке крови определяли с использованием тестсистемы «ProCon IF-gamma» общества с ограниченной ответственностью «Протеиновый контур», используя иммуноферментный анализ.
Состояние апоптоза опухолевых клеток Walker 256 анализировали по уровню экспрессии белков семейства Bcl-2 на парафиновых срезах с помощью непрямого стрептавидин-авидинового метода [6]. Для выявления Всl-2 и Bad использовали мышиные моноклональные антитела (ВD Biosciences), для выявления Вах применяли кроличьи поликлональные антитела (ВD Biosciences). Выраженность экспрессии антигенов в опухолевых клетках оценивали по интенсивности иммуногистохимического окрашивания по программе «Axio Vision 4.7.1» фирмы «Carl Zeiss» (Германия) и блока автоматических измерений. В программу вычислений вводили значение процента площади позитивно окрашиваемых опухолевых элементов.
Полученные количественные данные обрабатывали с использованием методов статистики [2], уровень значимости различий средних величин оценивали на основании t-критерия Стьюдента для уровня достоверности 95% (p<0,05).
Результаты и их обсуждение. Установлено, что содержание CD3+-лимфоцитов в крови у крыс с карциносаркомой Walker 256 на 7-е сутки постгипертермического периода достоверно (р<0,05) превосходит исходный уровень на 11,1%, хотя к 14-м суткам наблюдения эти различия исчезают. Аналогичная ситуация наблюдается и при анализе уровней CD4+, CD8+ и CD20+-лимфоцитов, когда увеличение содержания изучаемых лимфоцитов отмечается на 7-е сутки эксперимента при последующем снижении на 14-е сутки постгипертермического периода (табл. 1).

 

Таблица 1

Динамика параметров иммунитета у животных с карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии, M±m

Показатель

Сроки обследования животных

Показатель

Исходное состояние

7-е сутки после ОГ

14-е сутки после ОГ

CD3+-лимфоциты, %

52,4±2,10

58,0±2,33*

51,4±2,54

CD4+-лимфоциты,%

26,4±2,15

31,5±2,06*

26,5±1,95

CD8+-лимфоциты,%

16,1±1,25

18,8±1,11*

17,6±1,23

CD16+-лимфоциты,%

10,5±0,90

10,1±0,87

8,2±0,77

CD20+-лимфоциты,%

12,1±0,90

14,8±1,57*

11,5±0,88

IFN-γ, пкг/мл

7,01±0,89

14,1±1,21*

12,0±1,32*

Примечание: * – различия по сравнению с исходным состоянием, р<0,05.

 

Рассчитанный дополнительно показатель иммунорегуляторного индекса (CD4/CD8) не выявил значимых различий. Подобная закономерность отмечалась и для содержания CD16+-лимфоцитов в крови в группе животных с карциносаркомой Walker 256, подвергшихся воздействию ОГ.
Установлено, что концентрация IFN-γ в сыворотке крови животных с карциносаркомой Walker 256 после ОГ на 7-е и 14-е сутки постгипертермического периода превышает исходные результаты соответственно в 2,04 и 1,71 раза (р<0,05). Таким образом, особенности иммуномодулирующего влияния гипертермии (43,5°С) на животных – опухоленосителей заключаются в следующем: эффект ОГ проявляется ростом количества лимфоцитов (СD3+, СD4+, CD8+ и СD20+) на 7-е сутки и снижением к 14-м суткам эксперимента. На фоне временного повышения после ОГ лимфоцитов Тh 1-го типа отмечается более стойкое повышение содержания IFN-γ, что является отражением активности клеточных иммунных реакций организма в ответ на гипертермию.
Полагаем, что иммунологические сдвиги при гипертермии зависят прежде всего от температурного режима. A. Dieing et al. [11] показали, что в режиме гипертермии (41,8°С) происходит апоптоз различных субпопуляций лимфоцитов. После гипертермии (42,3°С) снижается уровень CD8+ и CD5+-лимфоцитов, а уровень CD4+-лимфоцитов не изменяется [14]. В то же время включение гипертермии в терапию саркомы SCCVII у мышей линии C3H нe приводит к увеличению числа CD3+ и CD8+-лимфоцитов [18]. Кроме того, при гипертермии часто встречается абскопальный эффект, что связано, вероятно, с интенсивной стимуляцией иммунной системы при массированной экспрессии опухолевых антигенов, вызванной повышением мембранной проницаемости при термическом воздействии [19].
При воздействии ОГ возрастает уровень экспрессии проапоптотических белков Bad и Bax. Так, показатели экспрессии белка Bad в клетках карциносаркомы Walker 256 на 7-е и 14-е сутки постгипертермического периода стали достоверно (p<0,05) выше соответственно в 2,05 и 2,15 раза по сравнению с исходным состоянием. Экспрессия уровня белка Вах была также выше соответствующего показателя до сеанса гипертермии (43,5°С), на 7-е и 14-е сутки в 3,52 и 1,69 раза соответственно (p<0,05), таблица 2.

 

Таблица 2

Динамика параметров апоптоза клеток карциносаркомы Walker 256 у животных после воздействия общей гипертермии, % (M±m)

Показатель

Сроки обследования животных

Показатель

Исходное состояние

7-е сутки после ОГ

14-е сутки после ОГ

Bcl-2

20,9±1,55

13,3±1,5*

9,1±1,41*

Bad

33,1±2

67,8±3,6*

71,0±1,7*

Bax

20,1±2

70,9±5*

34,0±1,6*

Примечание: * – различия по сравнению с исходным состоянием, р<0,05.

 

Высвобождение этих белков происходит при повышении проницаемости мембран митохондрий под контролем белков семейства Bcl-2/Bax, которые непрерывно взаимодействуют друг с другом, находясь в динамическом равновесии между гомои гетеродимерами [10]. Уровень экспрессии Вс1-2 в клетках карциносаркомы Walker 256 у крыс при воздействии ОГ на 7-е и на 14-е сутки эксперимента был достоверно ниже исходных показателей в 1,57 и 2,29 раза соответственно (p<0,05). Следовательно, особенностью термического воздействия на опухолевую ткань является проапоптотический эффект, который может носить и отсроченный характер. Подтверждением этого могут являться данные N. Meggyeshazi et al. [16], которые экспериментально установили, что апоптотическое повреждение клеток опухоли после однократной термической процедуры проградиентно нарастает в течение 3-х суток. При этом важное значение отводится стимуляции экспрессии белков HSP и p53, что сопровождается высокой системной иммуногенностью апоптотической реакции [7, 8].

Заключение. Поскольку гипертермия сегодня понимается как методика, не связанная с прямым термическим повреждением опухолевой ткани, то можно утверждать, что гипертермия способна оказывать иммуномодулирующий и апоптозстимулирующий эффекты.

×

Об авторах

А. В. Ефремов

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: eav48@yandex.ru
Россия, г. Новосибирск

М. Е. Тулеутаев

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: eav48@yandex.ru
Россия, г. Новосибирск

И. Д. Сафронов

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: eav48@yandex.ru
Россия, г. Новосибирск

Е. Н. Самсонова

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: eav48@yandex.ru
Россия, г. Новосибирск

И. А. Кривошапкин

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: eav48@yandex.ru
Россия, г. Новосибирск

Д. Л. Колодин

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: eav48@yandex.ru
Россия, г. Новосибирск

Е. В. Овсянко

Новосибирский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: eav48@yandex.ru
Россия, г. Новосибирск

Список литературы

  1. Владимирская, Е.Б. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста / Е.Б. Владимирская, А.А. Масчан, А.Г. Румянцев // Гематол. трансфузиол. – 1997. – № 5. – С. 4–9.
  2. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. – М., 1999. – 275 с.
  3. Ефремов, А.В. Патент 2165105 Российская Федерация. Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных / А.В. Ефремов [и др.] // Опубликовано 12.10.2001.
  4. Курпешев, О.К. Гипертермические методы лечения / О.К. Курпешев // Онкология: национальное руководство. – М.: ГЕОТАР-Медиа, 2008. – С. 438–447.
  5. Северин, Е.С. Проблемы и перспективы современной противоопухолевой терапии / Е.С. Северин, А.В. Родина // Успехи биологической химии, 2006. – Т. 46. – С. 43–64.
  6. Эллиниди, В.Н. Практическая иммуногистохимия: метод. реком. / В.Н. Эллиниди, Н.В. Аникиев. Н.А. Максимов. – СПб., 2002. – 207 с.
  7. Andocs, G. Oncothermia treatment induced immunogenic cancer cell death / G. Andocs [et al.] // Oncothermia J. – 2013. – №
  8. – Р. 28–37.
  9. Andocs, G. Upregulation of heat shock proteins and the promotion of damage-associated molecular pattern signals in a colorectal cancer model by modulated electrohyperthermia / G. Andocs [et al.] // Cell Stress Chaperones. – 2015. – Vol. 20 (1). – Р. 37–46.
  10. Bos, R. CD4+ T-cell help in the tumor milieu is required for recruitment and cytolytic function of CD8+ T lymphocytes / R. Bos, L.A. Sherman // Cancer Research. – 2010. – Vol. 70 (21). – Р. 8368–8377.
  11. Chinaiyn, A.M. Molecular ordering of the cell death pathway Bcl-2 and Bcl-X(L) function upstream of the CED-3-like apoptotic proteases / A.M. Chinaiyn // J. Biol. Chem. – 1996. – Vol. 271. Р. 4573–4576.
  12. Dieing, A. Whole body hyperthermia induces apoptosis in subpopulation of blood lymphocytes / A. Dieing [et al.] // Immunobiology. – 2003. – Vol. 207 (4). – P. 265–273.
  13. Fuggetta, M.P. In vitro effect of hyperthermia on natural cellmediated cytotoxicity / M.P. Fuggetta [et al.] //Anticancer Res. – 2000. – Vol. 20 (3A). Р. 1667–1672.
  14. Kalos, M. Biomarkers in T cell therapy clinical trials / M. Kalos // J. Transl. Med. – 2011. – № 9. – Р. 138.
  15. Kearns, R.J. The effects of extracorporal whole body hyperthermia on the functional and phenotypic features of canine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) / R.J. Kearns [et al.] // Clin. Exp. Immunol. – 1999. – Vol. 116 (1). – P. 188–192.
  16. Luchetti, F. Hyperthermia triggers apoptosis and affects cell adhesiveness in human neuroblastoma cells / R.J. Kearns [et al.] // Histol. Histopathol. – 2003. – Vol. 18 (4). – Р. 1041–1052.
  17. Meggyeshazi, N. DNA fragmentation and caspase-independent programmed cell death by modulated electrohyperthermia / N. Meggyeshazi [et al.] // Strahlenther Onkol. – 2014. – Vol. 190 (9). – Р. 815–822.
  18. Peter, M.E. The role of CD95 and CD95 ligand in cancer / M.E. Peter [et al.] // Cell Death Differ. – 2015. – Vol. 22 (4). – Р. 549–559.
  19. Qin, W. Modulated electro-hyperthermia enhances dendritic cell therapy through an abscopal effect in mice / W. Qin [et al.] // Oncol. Rep. – 2014. – Vol. 32 (6). – Р. 2373–2379.
  20. Yoon, S.M. Case of abscopal effect with metastatic non-small-cell lung cancer / S.M. Yoon, J.S. Lee // Oncothermia J. – 2012. – № 5. – Р. 53–57.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Эко-Вектор, 1970


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 77762 от 10.02.2020.