Changing immunity and apoptosis in animals with carcinosarcoma Walker 256 after exposure to whole body hyperthermia (43,5°C)

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The dynamics of immune parameters changes and the apoptosis in animals with carcinosarcoma Walker 256 after exposure to whole body hyperthermia (43,5°C) is analyzed. It was found that the features of immunomodulatory and apoptosis modulatory effects of hyperthermia (43,5°C) in animals with tumors are as follows: the effect of hyperthermia is manifested by increasing number of of lymphocytes (CD3+, CD4+, CD8+ and CD20+) on day 7 and decreasing to 14 th day of the experiment. Against the backdrop of a temporary increase of lymphocytes Th 1-type notes a persistent increase of interferon-γ, which is a reflection of the activity of the cellular immune reactions of the body in response to hyperthermia. Furthermore, it was found the increasing of expression levels of pro-apoptotic protein Bad, Bax and decreasing of level of expression of the protein Bcl-2 anti-apoptotic in posthyperthermal period. For example, protein expression indicators in Bad carcinosarcoma Walker 256 cells at the 7th and 14th day posthyperthermal period were significantly (p<0,05) higher, respectively, 2,05 and 2,15 times as compared with the initial state. The expression of Bax protein level was also higher than the corresponding figure before the session of hyperthermia (43,5°C), on the 7th and 14th day in 3,52 and 1,69 times, respectively (p<0,05). We assume that hyperthermia as the method that is not related to the direct thermal damage to the tumor tissue is capable to provide immunomodulatory and apoptosis modulatory effects.

Full Text

Введение. Современные методы терапии злокачественных опухолевых заболеваний не всегда достигают должного результата [5]. Поэтому все большее внимание приобретают альтернативные способы воздействия на злокачественный клеточный рост. Одним из таких способов регуляции активности опухолевого процесса может являться гипертермия. Ее использование в лечении опухолевых заболеваний в последнее время вызывает повышенный интерес в силу своей эффективности и общедоступности [4].

Известно, что злокачественные опухоли обладают иммунодепрессивным эффектом на иммунологическую реактивность организма, преодолеть который методами традиционной терапии не всегда возможно. Устойчивая противоопухолевая протекция достигается за счет индукции как CD8+ Т-клеточного, так и гуморального ответа [9]. Показано, что интерферонγ (IFN-γ) является важным цитокином, ответственным за развитие клеточных иммунных реакций, его уровни в крови имеют большое значение при оценке иммунного статуса при канцерогенезе. [13].
Показано, что процессы гиперплазии регулируются факторами роста и апоптозом. Механизм запуска последнего в гиперплазированной ткани может осуществляться через CD95-рецептор [17]. Считается, что апоптоз принадлежит к одному из механизмов гибели злокачественных клеток, и что его модуляция может изменять резистентность опухоли к терапии [1]. Поэтому важной задачей в этих условиях является поиск путей направленной коррекции иммунитета и стимуляции апоптоза опухолевых клеток. Показано, что гипертермия способна индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, а также значительно усиливать противоопухолевое действие химиотерапевтических средств [15]. Имеются данные об иммуномодулирующих свойствах гипертермии [12], в связи с чем целесообразно исследовать характер перестройки иммунной системы и активности апоптоза у животных – опухоленосителей при воздействии общей гипертермии.

Цель исследования. Изучить особенности изменения параметров иммунитета и апоптоза у крыс с карциносаркомой Walker 256 после сеанса общей гипертермии (43,5°С).

Материалы и методы . Исследования проведены на 75 крысах-самцах линии Wistar массой 180–200 г и возрастом 2,5 мес. Работа с животными выполнялась согласно директивам Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской де кларации. Для экспериментального опухолевого роста использовали перевиваемый штамм карциносаркомы Walker 256, поддерживаемый in vivo в лаборатории физиологической генетики Научноисследовательского института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (Новосибирск). Суспензию клеток Walker 256 вводили крысам в мышцу бедра (106 клеток в 0,1 мл 0,9% раствора NaCl). Через 5 суток после перевивки опухоли, когда ее объем достигал 2,5±0,5 см3, животных подвергали воздействию ОГ.
Способ моделирования искусственной ОГ у мелких лабораторных животных [3] основывался на разогревании крысы в резервуаре универсального водного термостата «BWT-U», предназначенного для точного поддержания установленной температуры в диапазоне от 25°С до 100°С. Уровень ОГ, при котором прекращали разогрев животных, определялся ректальной температурой 43,5°С (стадия теплового удара). Время разогревания животного было индивидуальным, не зависело от исходной температуры тела, массы и составляло не более 17 мин. Забор крови для исследования параметров иммунитета и апоптоза выполнялся перед ОГ (исходное состоянте), а также на 7-е и 14-е сутки после сеанса ОГ.
Иммунологическое исследование проводилось путем определения моноклональных антител (МАТ) к СD3, СD4, СD8, CD16 и СD20 антигенам (LifeSpan BioSciences и MyBioSource, Inc.) в реакции иммунной флюоресценции с учетом результатов на люминесцентном микроскопе «AXIO SCOPE A1 LED» фирмы «Carl Zeiss» (Германия). Концентрацию IFN-γ в сыворотке крови определяли с использованием тестсистемы «ProCon IF-gamma» общества с ограниченной ответственностью «Протеиновый контур», используя иммуноферментный анализ.
Состояние апоптоза опухолевых клеток Walker 256 анализировали по уровню экспрессии белков семейства Bcl-2 на парафиновых срезах с помощью непрямого стрептавидин-авидинового метода [6]. Для выявления Всl-2 и Bad использовали мышиные моноклональные антитела (ВD Biosciences), для выявления Вах применяли кроличьи поликлональные антитела (ВD Biosciences). Выраженность экспрессии антигенов в опухолевых клетках оценивали по интенсивности иммуногистохимического окрашивания по программе «Axio Vision 4.7.1» фирмы «Carl Zeiss» (Германия) и блока автоматических измерений. В программу вычислений вводили значение процента площади позитивно окрашиваемых опухолевых элементов.
Полученные количественные данные обрабатывали с использованием методов статистики [2], уровень значимости различий средних величин оценивали на основании t-критерия Стьюдента для уровня достоверности 95% (p<0,05).
Результаты и их обсуждение. Установлено, что содержание CD3+-лимфоцитов в крови у крыс с карциносаркомой Walker 256 на 7-е сутки постгипертермического периода достоверно (р<0,05) превосходит исходный уровень на 11,1%, хотя к 14-м суткам наблюдения эти различия исчезают. Аналогичная ситуация наблюдается и при анализе уровней CD4+, CD8+ и CD20+-лимфоцитов, когда увеличение содержания изучаемых лимфоцитов отмечается на 7-е сутки эксперимента при последующем снижении на 14-е сутки постгипертермического периода (табл. 1).

 

Таблица 1

Динамика параметров иммунитета у животных с карциносаркомой Walker 256 после воздействия общей гипертермии, M±m

Показатель

Сроки обследования животных

Показатель

Исходное состояние

7-е сутки после ОГ

14-е сутки после ОГ

CD3+-лимфоциты, %

52,4±2,10

58,0±2,33*

51,4±2,54

CD4+-лимфоциты,%

26,4±2,15

31,5±2,06*

26,5±1,95

CD8+-лимфоциты,%

16,1±1,25

18,8±1,11*

17,6±1,23

CD16+-лимфоциты,%

10,5±0,90

10,1±0,87

8,2±0,77

CD20+-лимфоциты,%

12,1±0,90

14,8±1,57*

11,5±0,88

IFN-γ, пкг/мл

7,01±0,89

14,1±1,21*

12,0±1,32*

Примечание: * – различия по сравнению с исходным состоянием, р<0,05.

 

Рассчитанный дополнительно показатель иммунорегуляторного индекса (CD4/CD8) не выявил значимых различий. Подобная закономерность отмечалась и для содержания CD16+-лимфоцитов в крови в группе животных с карциносаркомой Walker 256, подвергшихся воздействию ОГ.
Установлено, что концентрация IFN-γ в сыворотке крови животных с карциносаркомой Walker 256 после ОГ на 7-е и 14-е сутки постгипертермического периода превышает исходные результаты соответственно в 2,04 и 1,71 раза (р<0,05). Таким образом, особенности иммуномодулирующего влияния гипертермии (43,5°С) на животных – опухоленосителей заключаются в следующем: эффект ОГ проявляется ростом количества лимфоцитов (СD3+, СD4+, CD8+ и СD20+) на 7-е сутки и снижением к 14-м суткам эксперимента. На фоне временного повышения после ОГ лимфоцитов Тh 1-го типа отмечается более стойкое повышение содержания IFN-γ, что является отражением активности клеточных иммунных реакций организма в ответ на гипертермию.
Полагаем, что иммунологические сдвиги при гипертермии зависят прежде всего от температурного режима. A. Dieing et al. [11] показали, что в режиме гипертермии (41,8°С) происходит апоптоз различных субпопуляций лимфоцитов. После гипертермии (42,3°С) снижается уровень CD8+ и CD5+-лимфоцитов, а уровень CD4+-лимфоцитов не изменяется [14]. В то же время включение гипертермии в терапию саркомы SCCVII у мышей линии C3H нe приводит к увеличению числа CD3+ и CD8+-лимфоцитов [18]. Кроме того, при гипертермии часто встречается абскопальный эффект, что связано, вероятно, с интенсивной стимуляцией иммунной системы при массированной экспрессии опухолевых антигенов, вызванной повышением мембранной проницаемости при термическом воздействии [19].
При воздействии ОГ возрастает уровень экспрессии проапоптотических белков Bad и Bax. Так, показатели экспрессии белка Bad в клетках карциносаркомы Walker 256 на 7-е и 14-е сутки постгипертермического периода стали достоверно (p<0,05) выше соответственно в 2,05 и 2,15 раза по сравнению с исходным состоянием. Экспрессия уровня белка Вах была также выше соответствующего показателя до сеанса гипертермии (43,5°С), на 7-е и 14-е сутки в 3,52 и 1,69 раза соответственно (p<0,05), таблица 2.

 

Таблица 2

Динамика параметров апоптоза клеток карциносаркомы Walker 256 у животных после воздействия общей гипертермии, % (M±m)

Показатель

Сроки обследования животных

Показатель

Исходное состояние

7-е сутки после ОГ

14-е сутки после ОГ

Bcl-2

20,9±1,55

13,3±1,5*

9,1±1,41*

Bad

33,1±2

67,8±3,6*

71,0±1,7*

Bax

20,1±2

70,9±5*

34,0±1,6*

Примечание: * – различия по сравнению с исходным состоянием, р<0,05.

 

Высвобождение этих белков происходит при повышении проницаемости мембран митохондрий под контролем белков семейства Bcl-2/Bax, которые непрерывно взаимодействуют друг с другом, находясь в динамическом равновесии между гомои гетеродимерами [10]. Уровень экспрессии Вс1-2 в клетках карциносаркомы Walker 256 у крыс при воздействии ОГ на 7-е и на 14-е сутки эксперимента был достоверно ниже исходных показателей в 1,57 и 2,29 раза соответственно (p<0,05). Следовательно, особенностью термического воздействия на опухолевую ткань является проапоптотический эффект, который может носить и отсроченный характер. Подтверждением этого могут являться данные N. Meggyeshazi et al. [16], которые экспериментально установили, что апоптотическое повреждение клеток опухоли после однократной термической процедуры проградиентно нарастает в течение 3-х суток. При этом важное значение отводится стимуляции экспрессии белков HSP и p53, что сопровождается высокой системной иммуногенностью апоптотической реакции [7, 8].

Заключение. Поскольку гипертермия сегодня понимается как методика, не связанная с прямым термическим повреждением опухолевой ткани, то можно утверждать, что гипертермия способна оказывать иммуномодулирующий и апоптозстимулирующий эффекты.

×

About the authors

A. V. Efremov

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: eav48@yandex.ru
Russian Federation, г. Новосибирск

M. E. Tuleutayev

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: eav48@yandex.ru
Russian Federation, г. Новосибирск

I. D. Safronov

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: eav48@yandex.ru
Russian Federation, г. Новосибирск

E. N. Samsonova

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: eav48@yandex.ru
Russian Federation, г. Новосибирск

I. A. Krivoshapkin

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: eav48@yandex.ru
Russian Federation, г. Новосибирск

D. L. Kolodin

Новосибирский государственный медицинский университет

Email: eav48@yandex.ru
Russian Federation, г. Новосибирск

E. V. Ovsyanko

Новосибирский государственный медицинский университет

Author for correspondence.
Email: eav48@yandex.ru
Russian Federation, г. Новосибирск

References

  1. Владимирская, Е.Б. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста / Е.Б. Владимирская, А.А. Масчан, А.Г. Румянцев // Гематол. трансфузиол. – 1997. – № 5. – С. 4–9.
  2. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. – М., 1999. – 275 с.
  3. Ефремов, А.В. Патент 2165105 Российская Федерация. Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных / А.В. Ефремов [и др.] // Опубликовано 12.10.2001.
  4. Курпешев, О.К. Гипертермические методы лечения / О.К. Курпешев // Онкология: национальное руководство. – М.: ГЕОТАР-Медиа, 2008. – С. 438–447.
  5. Северин, Е.С. Проблемы и перспективы современной противоопухолевой терапии / Е.С. Северин, А.В. Родина // Успехи биологической химии, 2006. – Т. 46. – С. 43–64.
  6. Эллиниди, В.Н. Практическая иммуногистохимия: метод. реком. / В.Н. Эллиниди, Н.В. Аникиев. Н.А. Максимов. – СПб., 2002. – 207 с.
  7. Andocs, G. Oncothermia treatment induced immunogenic cancer cell death / G. Andocs [et al.] // Oncothermia J. – 2013. – №
  8. – Р. 28–37.
  9. Andocs, G. Upregulation of heat shock proteins and the promotion of damage-associated molecular pattern signals in a colorectal cancer model by modulated electrohyperthermia / G. Andocs [et al.] // Cell Stress Chaperones. – 2015. – Vol. 20 (1). – Р. 37–46.
  10. Bos, R. CD4+ T-cell help in the tumor milieu is required for recruitment and cytolytic function of CD8+ T lymphocytes / R. Bos, L.A. Sherman // Cancer Research. – 2010. – Vol. 70 (21). – Р. 8368–8377.
  11. Chinaiyn, A.M. Molecular ordering of the cell death pathway Bcl-2 and Bcl-X(L) function upstream of the CED-3-like apoptotic proteases / A.M. Chinaiyn // J. Biol. Chem. – 1996. – Vol. 271. Р. 4573–4576.
  12. Dieing, A. Whole body hyperthermia induces apoptosis in subpopulation of blood lymphocytes / A. Dieing [et al.] // Immunobiology. – 2003. – Vol. 207 (4). – P. 265–273.
  13. Fuggetta, M.P. In vitro effect of hyperthermia on natural cellmediated cytotoxicity / M.P. Fuggetta [et al.] //Anticancer Res. – 2000. – Vol. 20 (3A). Р. 1667–1672.
  14. Kalos, M. Biomarkers in T cell therapy clinical trials / M. Kalos // J. Transl. Med. – 2011. – № 9. – Р. 138.
  15. Kearns, R.J. The effects of extracorporal whole body hyperthermia on the functional and phenotypic features of canine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) / R.J. Kearns [et al.] // Clin. Exp. Immunol. – 1999. – Vol. 116 (1). – P. 188–192.
  16. Luchetti, F. Hyperthermia triggers apoptosis and affects cell adhesiveness in human neuroblastoma cells / R.J. Kearns [et al.] // Histol. Histopathol. – 2003. – Vol. 18 (4). – Р. 1041–1052.
  17. Meggyeshazi, N. DNA fragmentation and caspase-independent programmed cell death by modulated electrohyperthermia / N. Meggyeshazi [et al.] // Strahlenther Onkol. – 2014. – Vol. 190 (9). – Р. 815–822.
  18. Peter, M.E. The role of CD95 and CD95 ligand in cancer / M.E. Peter [et al.] // Cell Death Differ. – 2015. – Vol. 22 (4). – Р. 549–559.
  19. Qin, W. Modulated electro-hyperthermia enhances dendritic cell therapy through an abscopal effect in mice / W. Qin [et al.] // Oncol. Rep. – 2014. – Vol. 32 (6). – Р. 2373–2379.
  20. Yoon, S.M. Case of abscopal effect with metastatic non-small-cell lung cancer / S.M. Yoon, J.S. Lee // Oncothermia J. – 2012. – № 5. – Р. 53–57.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 1970 Eco-Vector


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 77762 от 10.02.2020.