A new molecular-genetic panel in the algorithm of diagnosis and treatment in patients with tiroid nodules

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Перечень основных диагностических и лечебных мероприятий у больных узловыми образованиями щитовидной железы (УОЩЖ) во всем мире един и практически не оставляет спорных моментов. Цитологическое исследование клеточного материала, полученного при пункционной тонкоигольной аспирационной биопсии (ПТАБ), остается «золотым стандартом» морфологической диагностики УОЩЖ на дооперационном этапе [1, 2]. Однако данный метод имеет высокую диагностическую значимость только в верификации рака ЩЖ (РЩЖ), которая снижается при выявлении фолликулярных неоплазий — образований с неопределенным потенциалом злокачественности, требующих хирургического лечения ввиду онкологической настороженности [3, 4]. В связи с этим в настоящее время продолжаются научные изыскания, направленные на создание новых и усовершенствование уже известных методов диагностики с целью повышения диагностических возможностей верификации образований ЩЖ и выработки наиболее рациональной тактики лечения [5–7]. Понимание того, что образование опухолевых клеток осуществляется вследствие мутаций в онкогенах, которые влекут за собой ингибирование апоптоза, неконтролируемую пролиферацию клеток и повышенную экспрессию определенных белков-рецепторов позволило начать поиск перспективных биомаркеров РЩЖ, а также проводить молекулярно-генетический анализ, направленный на выявление экспрессии различных генов и оценку соматических мутаций. Данные методы позволят на дооперационном этапе получить дополнительную информацию о распространенности онкологического процесса, биологических свойствах опухоли, степени ее агрессивности, риске рецидивирования, прогнозе эффективности хирургического лечения и радиойодтерапии [8–11].

Цель исследования — обосновать новую молекулярно-генетическую панель в лечебно-диагностическом алгоритме у больных узловыми образованиями щитовидной железы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включены 60 пациентов, страдающих различными УОЩЖ, прошедших обследование и лечение в клинике факультетской хирургии имени С.П. Федорова Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова в период с ноября 2019 по ноябрь 2020 г., которым с целью уточнения характера образований ЩЖ и лечебно-диагностической тактики общий стандарт обследования был дополнен определением молекулярно-генетической панели в клеточном материале, полученном при ПТАБ. Комплексное обследование больных осуществлялось в соответствии с российскими клиническими рекомендациями по диагностике и лечению хирургических заболеваний ЩЖ [2, 12]. Оперативные вмешательства выполнены с использованием трех методик: традиционной; минимально инвазивной эндоскопически-ассистированной (minimally invasive video-assisted thyroidectomy — MIVAT) и минимально инвазивной неэндоскопической (minimally invasive nonendoscopic thyroidectomy — MIT) [6, 7]. В целях облегчения поиска гортанных нервов и контроля их проводимости все операции выполняли с применением оборудования для интраоперационного нейромониторинга (ИОНМ) [2].

Исследование выполнено в два этапа: на первом этапе оптимизирована дооперационная диагностика высокодифференцированного РЩЖ (ВДРЩЖ) путем исследования уровня экспрессии Galectin-3 и мутации гена BRAF V600E; на втором этапе изучены прогностические возможности определения уровня экспрессии натрий-йодидного симпортера (NIS) в выявлении резистентности ВДРЩЖ к терапии радиоактивным йодом (РЙТ). Иммуноцитохимические и молекулярно-генетические методики исследования клеточного материала образований ЩЖ проводили в клинической диагностической лаборатории общества с ограниченной ответственностью «МедЛабСПб» (Россия) по усовершенствованной методике проточной флуоцитометрии (ПФЦ) и общепризнанной методике полимеразной цепной реакции (ПЦР) [5].

С целью определения показаний к оперативному вмешательству и оценки диагностической значимости молекулярно-генетических методов исследования по результатам цитологического исследования пункционного материала пациенты были разделены на четыре группы: 1-ю (n = 21) составили больные с выявленными признаками РЩЖ (Bethesda VI); 2-ю (n = 3) — с образованиями, подозрительными на РЩЖ (Bethesda V); 3-ю (n = 26) — с фолликулярными неоплазиями различной степени (Bethesda IV); 4-ю (n = 10) — с доброкачественными коллоидными узлами (Bethesda II) [13].

Все пациенты (n = 26), у которых по результатам окончательного гистологического исследования подтвердился ВДРЩЖ, с целью оценки эффективности проведенного лечения и прогнозирования резистентности к РЙТ были разделены на три группы: 1-ю (n = 10) составили больные, которые перенесли только операцию с последующим снижением уровня тиреоглобулина (ТГ) крови и антител к нему (АТ-ТГ) ниже пороговых значений; 2-ю (n = 9) — операцию с последующей РЙТ и отсутствием по данным контрольной сцинтиграфии всего тела патологического накопления радиофармпрепарата (РФП), а также определяемого уровня ТГ и АТ-ТГ; 3-ю (n = 7) — операцию с последующей РЙТ с отсутствием патологического накопления РФП при контрольной сцинтиграфии всего тела, но со стойким сохранением уровня ТГ крови.

Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Statistica for Windows 7.0 и Microsoft Excel (Microsoft Corp., Соединенные Штаты Америки). Осуществляли определение числовых характеристик исследуемых показателей и традиционных показателей описательной статистики, таких как число наблюдений, максимальное и минимальное значение признака, среднее арифметическое, стандартное отклонение и относительная величина. Достоверность различий переменных в выборках оценивали по t-критериям Стьюдента и Фишера (достоверным считали различие при р < 0,05 и f < 0,05). Оценку показателей информативности методов исследования осуществляли по таким показателям как чувствительность, специфичность, точность, положительная и отрицательная прогностическая ценность. Оценку эффективности бинарных классификаторов на основе логистической регрессии осуществляли методом ROC-анализа (Receiver Operator Characteristic) с определением порога или точки отсечения (cut-off value) и площади под кривой (Area Under Curve — AUC). Значение AUC 1.0 принимали за «идеальную» модель. Для обозначения числовых значений общепринятых физических величин и размеров использовали единицы СИ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что показаниями к хирургическому лечению были: фолликулярные опухоли и подозрение на РЩЖ — 29 (48,3%), РЩЖ — 21 (35%) и коллоидный зоб с компрессией органов шеи — 10 (16,7%). Тиреоидэктомия выполнена у 23 (38,3%) больных, гемитиреоидэктомия — у 27 (45%); субтотальная резекция ЩЖ — у 10 (16,7%). Хирургическое вмешательство было дополнено у 12 больных центральной (n = 8) и боковой (n = 4) лимфаденэктомией при подозрении на метастатическое поражение соответствующей группы лимфоузлов. Оперативные вмешательства с использованием традиционного доступа были выполнены у 24 (40%) пациентов, при помощи минимально инвазивных — у 36 (60%), табл. 1.

 

Таблица 1. Объем и варианты оперативных вмешательств у больных узловыми образованиями щитовидной железы

Table 1. Scope and options for surgical interventions in patients with thyroid nodular formations

Объем оперативного вмешательства	Методика операции
	традиционная, n = 24	минимально инвазивная, n = 36
Тиреоидэктомия, n = 23	6/2*/4**	17/4*
Гемитиреоидэктомия, n = 27	9/1*	18/1*
Резекция щитовидной железы, n = 10	9	1

Примечание: * в том числе выполнена центральная лимфаденэктомия; ** в том числе выполнена боковая лимфаденэктомия.

 

Результаты планового гистологического исследования операционного материала позволили установить, что в 1-й группе пациентов с цитологически подтвержденным РЩЖ (n = 21) окончательный диагноз ВДРЩЖ подтвердился у 20 (95,2%); у больных 2-й группы с подозрением на РЩЖ (n = 3) — у 2 (66,7%). У 1 больного 1-й группы и у 1 2-й были диагностированы фолликулярные аденомы. В 3-й группе пациентов с фолликулярными неоплазиями (n = 26) у 22 (84,6%) больных гистологически были определены фолликулярные аденомы, у 4 (15,4%) — ВДРЩЖ. У всех обследуемых 4-й группы, страдающих «коллоидным зобом» (n = 10), подтверждено наличие доброкачественного процесса в виде разной степени пролиферирующего коллоидного зоба (табл. 2).

 

Таблица 2. Результаты гистологического исследования операционного материала в обследуемых группах

Table 2. Results of histological examination of operating material in the examined groups

Заключение цитологического исследования	Заключение гистологического исследования	Количество пациентов
		абс.	%
Bethesda VI, n = 21/35%	Папиллярный рак	19	90,4
	Фолликулярный рак	1	4,8
	Фолликулярная аденома	1	4,8
Bethesda V, n = 3/5%	Папиллярный рак	2	66,7
	Фолликулярная аденома	1	33,3
Bethesda IV, n = 26/46,3%	Фолликулярная аденома	22	84,6
	Папиллярный рак	3	11,5
	Фолликулярный рак	1	3,9
Bethesda II, n = 10/16,7%	Узловой коллоидный зоб	10	100

 

Сопоставление результатов цитологического исследования клеточного материала, полученного при ПТАБ, с окончательным гистологическим исследованием операционного материала подтвердило высокие показатели чувствительности (100%) и отрицательной прогностической ценности (100%) данного метода диагностики в выявлении ВДРЩЖ. Однако с учетом группы фолликулярных неоплазий данный метод имеет низкую специфичность (29,4%), точность (60%) и положительную прогностическую ценность (29,8%).

Таким образом, по результатам гистологического исследования окончательный диагноз ВДРЩЖ различной распространенности был диагностирован у 26 больных (табл. 3). Установлено, что классический вариант гистологического типа папиллярного рака выявлен у 23 (88,5%), фолликулярный вариант папиллярного рака — у 1 (3,8%), фолликулярный рак — у 2 (7,7%).

 

Таблица 3. Распределение пациентов, страдающих высокодифференцированным раком щитовидной железы, в рамках классификации ТNM

Table 3. Distribution of patients with highly differentiated thyroid cancer within TNM classification

Т	N	M	Папиллярный рак, n = 24	Фолликулярный рак, n = 2
T1a-b	N0	M0	7	2
	N1а	M0	3	–
Т2	N0	M0	2	–
	N1a	M0	1	–
	N1b	M0	1	–
Т3a-b	N0	M0	4	–
	N1a	M0	4	–
	N1b	M0	1	–
Т4a-b	N1b	M0	1	–
I II III			9 14 1	2 – –

 

Применение международной системы стратификации рисков для больных ВДРЩЖ позволило определить показания к проведению РЙТ у 16 (61,5%) пациентов, отнесенных к группе промежуточного (n = 10) и высокого (n = 6) риска рецидивирования, в то время как у 10 (38,5%) больных, имеющих низкий риск рецидива, было обосновано только хирургическое лечение.

Определение Galectin-3 в клеточном материале методом ПФЦ установило среднее значение его экспрессии — 60,1 ± 15% среди 26 больных с подтвержденным ВДРЩЖ, минимальное при этом составило 47,6%, максимальное — 89,9%. Только у одного из пациентов, страдающего ВДРЩЖ, был отмечен исключительно низкий уровень экспрессии данного маркера — 9,5%, что, вероятнее всего, связано с фолликулярным вариантом гистологического типа папиллярного РЩЖ. Максимальные значения экспрессии Galectin-3 (86,5 и 89,9%) были обнаружены у больных фолликулярными карциномами. У пациентов, страдающих фолликулярными аденомами ЩЖ, выявлен большой разброс уровней экспрессии Galectin-3: максимальное значение составило 57,2%, минимальное — 1,3% и в среднем — 26,5 ± 17,9%. Среди всех 10 больных коллоидным зобом экспрессия данного маркера не превышала 27,8% (рис. 1).

 

Рис. 1. Результаты исследования уровня экспрессии Galectin-3 методом проточной флуоцитометрии в доброкачественных и злокачественных образованиях щитовидной железы

Fig. 1. Results of the study of the level of Galectin-3 expression by flow fluocytometry in benign and malignant thyroid tumors

 

По данным ROC-анализа, оптимальной отсечкой для разделения доброкачественных и злокачественных УОЩЖ по уровню экспрессии Galectin-3 стало значение 47,6%. Полученные результаты позволили установить высокие показатели чувствительности (96,2%), специфичности (88,2%), точности (91,7%), положительной (86,2%) и отрицательной (96,8%) прогностической ценности определения Galectin-3 методом ПФЦ (AUC = 0,950) (рис. 2).

 

Рис. 2. ROC-анализ эффективности исследования уровня экспрессии Galectin-3 методом проточной флуоцитометрии в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных образований щитовидной железы

Fig. 2. ROC-analysis of the effectiveness of the study of the level of Galectin-3 expression by flow fluocytometry in the differential diagnosis of benign and malignant thyroid tumors

 

Проведенный анализ результатов оценки Galectin-3 в группах больных показал, что среди пациентов, страдающих цитологически подтвержденным РЩЖ (n = 21), и с подозрением на него (n = 3) низкий уровень экспрессии маркера в 2 случаях (9,5 и 10,2%) указывал на доброкачественный процесс. В группе больных фолликулярными неоплазиями отмечено, что у 18 (69,2%) из 26 пациентов его экспрессия была снижена и колебалась от 1,34 до 45,8%, а гистологическая картина во всех случаях характеризовалась доброкачественными изменениями. Лишь у 4 (13,8%) пациентов, страдающих фолликулярными аденомами, уровни экспрессии Galectin-3 превышали его пороговый уровень в 47,6% и составили 49,5; 51,1; 53,9 и 57,2% соответственно. У 4 пациентов с высокими значениями экспрессии данного маркера (58,3; 60,4; 65,8 и 89,9%) был верифицирован ВДРЩЖ.

Таким образом, определение экспрессии Galectin-3 в пункционном материале позволяет улучшить диагностику РЩЖ на дооперационном этапе, предполагать его наличие у пациентов, страдающих фолликулярными неоплазиями, с высокими значениями экспрессии данного маркера и, наоборот, может свидетельствовать о доброкачественном процессе у больных с цитологически «злокачественным» заключением с более низкой его экспрессией.

Проведенный анализ выявления мутации V600E гена BRAF методом ПЦР в клеточном материале, полученном при ПТАБ, позволил установить, что среди 26 пациентов, страдающих гистологически доказанным ВДРЩЖ, данный маркер определен у 22 (84,6%). При этом BRAF-мутация отмечена у 22 из 24 больных папиллярной карциномой ЩЖ и исключена при фолликулярных карциномах. BRAF-мутация также не выявлена у 10 пациентов, страдающих коллоидным зобом.

Оценка мутации V600E гена BRAF в группах больных показала, что среди 21 пациента, страдающего цитологически подтвержденным РЩЖ, у 2 BRAF-отрицательных пациентов диагностированы фолликулярная аденома и фолликулярная карцинома. У 2 больных 2-й группы папиллярная карцинома ЩЖ сопровождалась наличием мутации, у 1 пациента, страдающего фолликулярной аденомой, мутация не выявлена. В 3-й группе пациентов BRAF-мутация выявлена у 3 больных папиллярной карциномой и у 1 — фолликулярной аденомой, тогда как остальные пациенты были BRAF-отрицательными.

Изучение взаимосвязи BRAF-мутации с факторами агрессивного течения РЩЖ показало, что данная мутация выявлена у 4 пациентов, страдающих мультицентричной опухолью, у 11 — с метастатическим поражением регионарных лимфоузлов и у 10 — с признаками прорастания капсулы ЩЖ и/или распространения карциномы за ее пределы. В то же время у 2 BRAF-отрицательных больных ни одного из вышеперечисленных факторов не выявлено (см. табл. 3). Полученные данные свидетельствуют о том, что выявленная склонность к более агрессивному течению BRAF-положительного папиллярного РЩЖ требует выполнения радикального объема оперативного вмешательства — тиреоидэктомии и профилактической центральной лимфаденэктомии даже при микрокарциномах. Отсутствие данной мутации позволяет планировать органосберегающий объем резекции ЩЖ.

Изучение диагностической значимости позволило установить, что чувствительность выявления мутации V600E гена BRAF методом ПЦР составила 84,6%, специфичность — 97,1%, точность — 91,7%, положительная и отрицательная прогностическая ценность — 95,7 и 89,2% соответственно.

Таким образом, мутация V600E гена BRAF, определенная в пункционном материале методом ПЦР, является высокоспецифичным маркером папиллярной карциномы ЩЖ. Выявление BRAF-мутации у пациентов, страдающих фолликулярной опухолью, с вероятностью до 97,1% позволяет говорить о наличии папиллярного РЩЖ с более агрессивным течением, в то время как BRAF-статус больных доброкачественными образованиями является отрицательным. Также нельзя исключить наличие BRAF-отрицательного фолликулярного и папиллярного РЩЖ.

Оценка уровня мембранной экспрессии NIS методом ПФЦ в клеточном материале ПТАБ показала возможность его использования в качестве прогностического для оценки эффективности РЙТ. Так, высокие уровни экспрессии NIS (4,8 ± 3,5 и 4,4 ± 1,3%) наблюдались в первых двух группах пациентов, где было проведено только хирургическое лечение ввиду низкого риска рецидива заболевания (n = 10) и где операции дополнены эффективно проведенной РЙТ (n = 9). Самое низкое среднее значение экспрессии данного белка — 1,8 ± 0,5% отмечено у пациентов 3-й группы (n = 7) с резистентностью к РЙТ. Полученные данные позволили установить критичный уровень экспрессии NIS для развития радиойодрезистентности — < 1,8%, что требует обязательного выполнения тиреоидэктомии с профилактической лимфаденэктомией ввиду повышенного риска рецидива ВДРЩЖ даже после комбинированного лечения (рис. 3).

 

Рис. 3. Уровень экспрессии NIS по группам эффективности терапии радиоактивным йодом (РЙТ)

Fig. 3. Level of NIS expression by groups of radioiodine therapy efficacy

 

Таким образом, применение предложенной молекулярно-генетической панели в лечебно-диагностическом алгоритме у пациентов с образованиями ЩЖ позволяет более точно определить характер патологических изменений в ЩЖ на основе изучения генетических механизмов формирования и развития онкологического процесса и выбрать наиболее рациональный вариант хирургического лечения в каждом конкретном случае с целью улучшения его результатов и снижения риска рецидивирования онкологического процесса.

ВЫВОДЫ

1. Выявление уровня экспрессии Galectin-3 ниже и выше 47,6% в клеточном материале фолликулярных неоплазий методом ПФЦ на дооперационном этапе позволяет прогнозировать наличие у пациента аденомы или ВДРЩЖ с точностью до 91,7% соответственно.
2. Выявление мутации BRAF V600E в клеточном материале опухолей методом ПЦР с вероятностью до 97,1% указывает на наличие папиллярной карциномы щитовидной железы. BRAF-статус пациентов, страдающих фолликулярными карциномами и доброкачественными образованиями, является отрицательным. BRAF-положительные папиллярные карциномы характеризуются более агрессивным течением, что требует выполнения радикального объема оперативного вмешательства — тиреоидэктомии и профилактической центральной лимфаденэктомии даже при микрокарциномах.
3. Уровень мембранной экспрессии натрий-йодидного симпортера более 1,8%, определенный методом ПФЦ, позволяет спрогнозировать хороший лечебный эффект от терапии радиоактивным йодом, а менее 1,8% — ее неэффективность, что требует обязательного выполнения тиреоидэктомии с профилактической лимфаденэктомией ввиду повышенного риска рецидива заболевания даже после комбинированного лечения.
4. Применение усовершенствованного лечебно-диагностического алгоритма, с учетом предложенной молекулярно-генетической панели, позволяет более точно определить характер патологических изменений в щитовидной железе и выбрать наиболее рациональный вариант хирургического лечения в каждом конкретном случае в целях улучшения его результатов и снижения риска рецидивирования онкологического процесса.

About the authors

Pavel N. Romashchenko

Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: romashchenko@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-1405-7660
SPIN-code: 3850-1792

doctor of medical sciences, professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Nicolay A. Maistrenko

Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: nik.m.47@mail.ru
SPIN-code: 2571-9603

doctor of medical sciences, professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Denis S. Krivolapov

Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Email: d.s.krivolapov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9499-2164
SPIN-code: 2195-5001

candidate of medical sciences

Russian Federation, Saint Petersburg

Maria S. Simonova

Military Medical Academy named after S.M. Kirov of the Ministry of Defense of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: mariasimonova62@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8359-1875
SPIN-code: 6004-1995

clinical resident

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files