Hair research for the diagnosis of psychoactive substance use

Full Text

Введение. В настоящее время все более актуальными становятся проблемы наркотической зависимости как среди взрослых людей, так и среди подростков и молодежи [2]. Наркомания – это общее название болезней, проявляющихся влечением к постоянному приему в возрастающих количествах наркотических, психотропных и иных токсических веществ вследствие стойкой психической и физической зависимости от них с развитием абстиненции при прекращении их приема, что приводит к глубоким изменениям личности и другим расстройствам психики, а также к нарушениям функций внутренних органов. Масштабы и темпы распространения наркомании в стране таковы, что ставят под угрозу здоровье молодежи и будущее значительной ее части, социальную стабильность российского общества в уже ближайшей перспективе [3].

Согласно блоку F10–F19 класса V Международной классификации болезней 10-го пересмотра (МКБ-10), принятой в России в качестве единого нормативного документа для учета заболеваемости, причин об- ращений населения в медицинские учреждения всех ведомств, причин смерти, идентификация психоактивного вещества должна основываться на возможно большем числе источников информации. К ним относятся данные, сообщенные самим индивидом,
результаты лабораторных исследований биологических объектов (биологические жидкости, придатки кожи), характерные соматические и психологические признаки, клинические и поведенческие симптомы, а также другие очевидные данные, такие как вещество, находящееся в распоряжении пациента, или информация от третьих лиц [5]. Вопрос диагностики наркомании и токсикомании возникает в тех случаях, когда больной скрывает их наличие у него. При добровольном обращении за лечением, когда больной заявляет, какой препарат является предметом его злоупотребления, диагностика не представляет сложности. В случаях, когда больной скрывает наличие у него наркомании или токсикомании, диагностика крайне сложна. Приходится ориентироваться на обнаружение комплекса явлений, которые дали бы возможность диагностировать наличие заболевания. Диагностику наркомании или токсикомании можно проводить по следующим критериям [10]:

– выявление в анамнезе приема больным в качестве лечебного препарата какого-либо психоактивного вещества или самолечение этими веществами, сведения от родственников о регулярном употреблении обследуемым лицом психоактивного вещества;

– наличие на коже следов частых инъекций, рубцов от мелких абсцессов, пигментных пятен после кровоподтеков, в особенности на локтевых сгибах, на бедрах и т. д. Эти данные весьма характерны для людей, которые используют внутривенные вливания или подкожные инъекции;

– возникновение абстинентного синдрома после короткого периода госпитализации с прекращением доступа к психоактивным веществам или обращения больного к врачу за лечебной помощью в состоянии, которое можно расценивать как абстинентный синдром;

– наличие психических изменений, возникших в связи с длительным употреблением психоактивных веществ (изменение характера поведения, резкие перепады настроения, нарушение внутрисемейных отношений).

– соматические, в том числе неврологические, изменения, которые могут дать основание считать их возникшими в связи с длительным употреблением вышеуказанных веществ.

– обнаружение в биологическом материале (слюна, моча, пот, кровь, волосы, ногти) психоактивных веществ или их специфических метаболитов – лабораторные методы исследования [10].

В последнее время появилось достаточно большое число публикаций на тему методов обнаружения наркотических, психотропных и иных токсических веществ, а также их основных метаболитов в биологическом материале человека с использованием высокочувствительного аналитического оборудования. Но самой главной остается проблема надлежащей пробоподготовки биологических объектов, так как это основной и наиболее важный этап в лабораторном исследовании наличия токсических веществ. Процесс пробоподготовки включает три основные стадии: изолирование токсиканта из биологического материала, очистку полученных извлечений и концентрирование экстракта с последующей в случае необходимости дериватизацией пробы. Самым важным этапом в процессе пробоподготовки является стадия изолирования ксенобиотика из биологического объекта, так как именно на данном этапе можно частично или полностью потерять токсикант и впоследствии не обнаружить его даже при использовании современного и высокочувствительного аналитического оборудования.

В практике химико-токсикологических и судебно-химических лабораторий в настоящее время наиболее часто применяют методику кислотного и щелочного гидролиза с последующей жидкость-жидкостной экстракцией для изолирования токсиканта из биологического объекта и анализа извлечений.

Некоторые авторы [7, 12–14] для исследования основных классов наркотических, психотропных и других токсических веществ предлагают метод мягкого энзиматического (ферментативного) гидролиза биообъектов. Условия проведения их подбирают таким образом, чтобы фермент проявлял свою максимальную активность и при этом лабильные вещества не подвергались гидролизу.

На базе Санкт-Петербургского государственного химико-фармацевтического университета начиная с 2009 г. проводятся исследования по разработке методик ферментативного гидролиза следующих биообъектов: плазма крови [9], волосы (шерсть) [8] с применением протеолитических ферментов (трипсин, химотрипсин, химопсин, пепсин и папаин).

Проведенные Н.А. Чувиной [9] исследования показали и доказали перспективность применения методик гидролиза трипсином, химотрипсином и химопсином для изолирования ряда лекарственных веществ из плазмы крови, что позволило продолжить исследования по разработке методик энзимного гидролиза, используя в качестве объектов волосы.

Цель исследования. Разработка методик изолирования ряда лекарственных средств из волос как объекта химико-токсикологического анализа с применением гидролиза протеолитическими ферментами (трипсин, химотрипсин, химопсин и папаин) и апробация их на экспертном материале.

Материалы и методы. Эксперименты проводили с использованием следующих реактивов: субстанция фенобарбитала по фармакопейной статье (ФС) 2.1.0041.15, субстанция дифенгидрамина гидрохлорид по ФС 42-0232-07, ферменты папаин фирмы «Вектон», трипсин, химотрипсин и химопсин фирмы «Самсон-Мед», субстанция трилона Б (чда), субстанция цистеина, микрогранулированная пудра для обесцвечивания волос (до 7 тонов) и 6% оксигент фирмы «Estel Princess Essex». Для проведения исследования использовали лабораторное оборудование: вибрационную шаровую мельницу «RetschMM-200», настольную центрифугу «Hettich Rotanta 460 R», роторную мешалку «Intelli — MixerRM-1L», аналитические весы «Sartorius СР224S», газовый хромато- граф с масс-селективным детектором «Agilent 7890 A/5977 MSD» на колонке «HP — 5 ms» (30м × 0,25мм × 0,25 мкм), управление с помощью программы Mass Hunter GCMS. Полученные данные обрабатывали в программах Mass Hunter Qualitative Analysis и Mass Hunter Quantitative Analysis.

В проводимом эксперименте использовали шерсть лабораторных животных – морских свинок белого, рыжего и черного природного окраса, срезанную по истечении каждых 28 дней эксперимента. Животные ежедневно получали раствор фенобарбитала и димедрола в дозе, соответствующей суточной дозе для человека. Протеолитические ферменты: трипсин, химотрипсин, химопсин и папаин – выбирали, основываясь на аминокислотном составе белков шерсти (волос). В качестве модельных лекарственных веществ (МЛВ) выбрали фенобарбитал и димедрол, которые ежедневно в виде 0,1 % водного раствора перорально вводили лабораторным животным [8].

Полученные навески шерсти промывали от внешних загрязнений (вода очищенная, метанол) и измельчали в шаровой мельнице до порошкообразной массы (23 ГГц, 15 мин). Метанол, полученный после промывки образцов шерсти, анализировали в представленных ниже условиях.

Гидролиз химопсином, трипсином и химотрипсином проводили по следующей методике: к навеске шерсти добавляли раствор фермента в фосфатном буфере (рН 7,4) в соотношении 1:100, термостатировали (37ОС, 3 ч), пробы центрифугировали (4600 об/мин, 10 мин), центрифугат отбирали. К осадку добавляли вторую порцию раствора фермента, выдерживали следующие 3 ч в аналогичных условиях. Гидролиз папаином выполняли в следующих условиях: к навеске шерсти добавляли раствор фермента в ацетатном буфере (рН 4,7) в соотношении 1:100, термостатировали (37ОС, 3 ч), пробы центрифугировали (4600 об/мин, 10 мин), центрифугат отбирали. К осадку добавляли вторую порцию раствора фермента, выдерживали следующие 3 ч в аналогичных условиях. Общее время ферментативного гидролиза составило 6 ч. Извлечение фенобарбитала (рН=2) и дифенгидрамина (рН=9–10) проводили жидкость-жидкостной экстракцией порциями хлороформа по 3 мл 3 раза [8].

Для сравнения эффективности работы методик ферментативного гидролиза белков шерсти (волос) использовали методики кислотного и щелочного гидролиза как наиболее часто используемые в практике химико-токсикологических лабораторий и судебно- химических отделений [6, 7].

Полученные экстракты из проб шерсти исследовали с помощью газовой хроматографии на хроматографе «Agilent 7890 A/5977 MSD». Ввод пробы осуществляли автоматически. Условия анализа: газ-носитель – гелий, скорость потока через колонку 0,8 мл/мин, температура испарителя 280ОС, температура интерфейса МС детектора 290ОС, температура колонки программируемая: начальная – 80ОС в течение 0,4 мин, нагревание со скоростью 50ОС/мин до 100ОС, далее 30ОС /мин до 300ОС с выдержкой при конечной температуре 5 мин. Режим сканирования: по полному ионному току в диапазоне масс m\z 40–500 а. е. м.

Количественное определение дифенгидрамина и фенобарбитала проводили с помощью газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ МС), расчет вели по градуировочному графику, построенному по стандартным растворам субстанции дифенгидрамина гидрохлорида и фенобарбитала. Методики количественного определения ГХ МС были валидированы [8]. На начальном этапе эксперимента проводили изучение фонового уровня эндогенных веществ в природно окрашенной (белая, черная и рыжая) шерсти контрольных животных, которым в течение эксперимента вводили воду очищенную.

Результаты и их обсуждение. Установлено, что состав белых, черных и рыжих образцов шерсти сопоставимый, но интенсивность пиков существенно выше у природно рыжих образцов (рис. 1, 2).

 

Рис. 1. Хроматограмма и масс-спектр экстракта после ферментативного гидролиза образцов белой шерсти контрольного животного

 

Рис. 2. Хроматограммы извлечений эндогенных веществ из черной (а) и рыжей (б) шерсти контрольных животных после ферментативного гидролиза

 

Таблица 1. Количественное содержание фенобарбитала и дифенгидрамина в образцах шерсти после ферментативного гидролиза, n=6 (р=95%)

Окрас шерсти	Метрологические характеристики	Протеолитические ферменты
		химопсин	химотрипсин	папаин
Фенобарбитал
Белая	Х±ЛХ, нг/мг	29,26±0,65	30,78±0,91	29,13±0,43
	Е, %	2,23	2,94	1,48
	CV, %	0,87	1,15	0,57
Черная	Х±ЛХ, нг/мг	20,23±1,24	22,60±1,51	24,07±1,08
	Е, %	6,15	6,70	4,49
	CV, %	2,67	2,74	1,95
Рыжая	Х±ДХ, нг/мг	22,19±0,75	6,95±3,58	26,11±3,49
	Е, %	3,37	13,29	13,36
	CV, %	1,31	4,18	5,19
Дифенгидрамин
Белая	Х±ЛХ, нг/мг	23,07±0,92	23,20±0,95	25,47±0,75
	Е, %	3,98	4,11	2,96
	CV, %	1,55	1,60	1,15
Черная	Х±ЛХ, нг/мг	23,66±3,26	32,24±3,15	23,64±2,81
	Е, %	13,79	9,78	11,89
	CV, %	5,36	4,24	5,16
Рыжая	Х±ЛХ, нг/мг	17,60±2,11	19,95±1,23	18,74±2,54
	Е, %	11,98	6,17	13,54
	CV, %	5,19	2,40	6,72

 

Показано, что наибольшее содержание фенобарбитала и дифенгидрамина в пробах шерсти получено в экстрактах после гидролиза папаином, химотрипсином и химопсином, что объясняется низкой специфичностью данных ферментов и сродством их к аминокислотам в последовательностях белков волос (шерсти) (табл. 1).

После последней стрижки животным прекратили давать раствор димедрола и фенобарбитала, отбор шерсти провели через 28 дней. Параллельно после прекращения приема веществ проводили забор мочи в течение нескольких дней. Из мочи проводили прямую жидкость-жидкостную экстракцию хлороформом при рН 9–10 (для дифенгидрамина), при рН 2 (для фенобарбитала) и исследовали ГХ МС (табл. 2). Димедрол в моче был обнаружен на 4-й день, фенобарбитал – на 11-й день в следовых количествах 2,40 мкг/мл и 0,90 – 1,50 мкг/мл соответственно. Эти результаты согласуются с данными литературы о фармакокинетических параметрах данных веществ [14, 15].

 

Таблица 2. Количественное содержание фенобарбитала и дифенгидрамина в образцах черной шерсти после ферментативного гидролиза через 28 дней после прекращения приема веществ, n=6 (р=95%)

Фермент	Метрологические характеристики	Фенобарбитал	Дифенгидрамин
Химопсин	±ΔX, нг/мг	19,85±0,81	7,04±1,11
Химопсин	ɛ, %	4,07	15,71
Химопсин	CV, %	1,77	6,11
Папаин	±ΔX, нг/мг	18,91±0,73	5,71±1,68
Папаин	ɛ, %	3,88	29,39
Папаин	CV, %	1,93	11,43

 

Разработанные методики ферментативного гидролиза были апробированы на образцах волос освидетельствуемых лиц, собранных согласно рекомендациям Приказа Минздрава Российской Федерации от 27.01.2006 г. № 40. Если масса образцов волос была 300 мг и более, проводили параллельно кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз. При наличии массы образцов волос 100 мг и менее проводили только ферментативный гидролиз. Всего за время исследования было проанализировано 118 проб волос. 14 образцов показали положительный анализ на наличие наркотических, психотропных и других токсических веществ, таких как метамфетамин, метилэкгонин, кокаин, амфетамин, форметорекс, пировалерон, метадон, тетрагидроканнабинол, фенобарбитал, тропикамид, димедрол, сальбутамол, никотин.

Применение разработанной методики гидролиза папаином в образцах волос обследуемых лиц также позволило обнаружить в пробе флюконазол, который характеризуется длительным периодом полувыведения, что позволяет назначать его однократно при вагинальном кандидозе и 1 раз в сутки или 1 раз в неделю – по другим показаниям [4].

При проведении апробации разработанных методик ферментативного гидролиза были получены следующие результаты. У пациента «А» был произведен отбор волос в количестве, достаточном для проведения параллельно кислотного, щелочного и ферментативного гидролиза. На хроматограммах после кислотного (рис. 3 а) и щелочного гидролиза (рис. 3 б), кроме пиков эндогенных веществ, был обнаружен пик никотина. На хроматограмме после гидролиза папаином (рис. 3 в), кроме пиков эндогенных веществ и пика никотина, был идентифицирован пик пировалерона. Данное психотропное вещество (пировалерон) не было обнаружено в пробах волос после проведения кислотного и щелочного гидролиза даже на уровне базовой линии (на уровне шума) (рис. 3).

 

Рис. 3. Хроматограммы и масс-спектры экстрактов после кислотного (а), щелочного (б) и ферментативного гидролиза папаином (в) образцов волос пациента «А»

 

Полученные результаты показали достоинства и возможности методики ферментативного гидролиза папаином с целью проведения скринингового исследования проб волос. В некоторых случаях (согласно направлению на химико-токсикологическое исследование) забор биоматериала (волос) осуществляли параллельно отбору другого биообъекта – мочи. Дополнительно забор волос проводили с целью доказательства наличия и отсутствия факта употребления наркотических, психотропных и иных токсических веществ или для подтверждения продолжительной ремиссии у пациентов, находящихся на диспансер- ном наблюдении, так как обнаружение большинства токсических веществ в моче возможно лишь в сроки до 7 дней с момента последнего употребления. При проведении параллельного исследования проб мочи и волос пациента «Б», направленного для подтверждения ремиссии, были обнаружены только никотин и его метаболиты: котинин и гидроксикотинин. В образцах волос пациента «В», помимо никотина, был обнаружен амфетамин, что является доказательством факта употребления пациентом психотропного вещества (эпизодическое употребление без выраженной клинической картины и психического расстройства). Данный результат является основанием для продолжения диспансерного наблюдения пациента «В» и повторного направления на химико-токсикологическое исследование.

Заключение. В последнее время вопросы, связанные с исследованием волос на предмет обнаружения психоактивных веществ, являются актуальными. Анализ волос позволяет не только установить факт употребления наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, но и выявить продолжи- тельность, периодичность и срок давности их приема (обнаружение токсикантов в организме спустя недели, месяцы после окончания их приема). Все вышеизложенное показывает преимущество исследования волос перед исследованиями биожидкостей (плазма крови, кровь, моча).

В последнее время с целью установления факта употребления запрещенных и (или) лекарственных веществ для решения социальных вопросов в рамках судебного разбирательства (опекунство, судебные разбирательства по вопросам наследства, уголовные преступления, связанные с употреблением наркотических или иных психотропных веществ) граждан по решению суда направляют для обязательного прохождения исследования на факт употребления психоактивных веществ, где в качестве биологического материала указаны волосы. Данная практика уже давно введена в странах Европы, например в Германии, где исследование волос является обязательным в случае окончания срока лишения лицензии на право управления транспортным средством водителем по причине управления в состоянии наркотического опьянения [11].

Химико-токсикологическое исследование волос позволяет психиатрам-наркологам контролировать ремиссию у пациента благодаря возможности установления эпизодического употребления (без выраженной клинической картины) психоактивных веществ в сроки от 1 до 6 месяцев (в зависимости от длины материала).

Отравления химическими веществами остаются весьма значимыми не только для гражданских лиц, но и для военнослужащих, являясь одной из ведущих причин инвалидизации и смертности [1]. В этой связи использование волос в качестве объекта химико-токсикологического анализа в рамках проведения предварительных и периодических медицинских осмотров, включая медицинское освидетельствование, для военнослужащих частей постоянной боевой готовности и ряда военно-учетных специальностей (операторы боевых расчетов ракетных войск стратегического назначения, летчики военно-космических войск, личный состав надводных и подводных кораблей Военно-морского флота) является весьма актуальным. Проведение данного медицинского контроля позволяет диагностировать как острое, так и хроническое отравление различными токсикантами. Это позволит не только своевременно назначить соответствующее лечение, но и провести профилактические мероприятия по предупреждению распространения данных профессиональных заболеваний химической этиологии [1].

About the authors

Yu. V. Slustovskaya

St. Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Author for correspondence.
Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

M. V. Krysko

St. Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

O. Yu. Strelova

St. Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

V. N. Kuklin

St. Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: vmeda-nio@mil.ru
Russian Federation, St. Petersburg

References

Supplementary files