Влияние рекомбинантного флагеллина на систему кроветворения у крыс при остром радиационном поражении



Цитировать

Полный текст

Аннотация

В опыте на облученных крысах в динамике изучено влияние профилактического и терапевтического введения рекомбинантного флагеллина на течение и исходы острого радиационного поражения, а также показатели периферической крови. Установлено, что противолучевая активность рекомбинантного флагеллина наиболее эффективно проявляется при профилактическом его введении за 15–30 мин до облучения. Так, при облучении крыс в дозе 6 Гр выживаемость животных контрольной группы к 30-м суткам составила 50±14%, а величина средней продолжительности жизни 23±3 сут. В случае профилактического введения рекомбинантного флагеллина в дозе 100 мкг/кг выживаемость облученных крыс увеличивалась на 33%, а величина средней продолжительности жизни на 5 сут и составила 83±11 и 28±2 сут соответственно. Введение рекомбинантного флагеллина в дозировках 1 и 10 мкг/кг оказалось малоэффективным. При введении рекомбинантного флагеллина после облучения, радиозащитного действия препарата выявить не удалось. Для выяснения механизмов действия рекомбинантного флагеллина исследовано его влияние на показатели периферической крови облучённых животных. У животных контрольной группы, облученных в дозе 6 Гр, в периферической крови отмечалась выраженная лейкопения. К 3-м суткам после облучения отмечалось снижение уровня лейкоцитов до 5,1×109/л. По мере развития гематологического синдрома острого радиационного поражения, лейкопения прогрессировала и к 9-м суткам уровень лейкоцитов составил 3,2×109/л. На 14-е сутки отмечалось постепенное восстановление пула лейкоцитов, при котором отмечалось увеличение показателя почти в 2 раза по сравнению с 9-ми сутками, что составило 7×109/л. Восстановление уровня лейкоцитов до референтных значений регистрировали к 25-м суткам, когда их уровень составил 31×109/л. Все это свидетельствует о том, что введение рекомбинантного флагеллина до облучения в дозировке 100 мкг/кг, оказывает защитное действие на кроветворные клетки и клетки костного мозга облученных крыс в дозе 6 Гр. Полученные результаты подтверждают данные литературы о перспективности проведения дальнейших исследований, направленных на разработку флагеллинсодержащих средств химической защиты от лучевого поражения.

Полный текст

Введение. Широкое использование источников ионизирующих излучений в различных областях жизнедеятельности человека создаёт высокие риски возникновения чрезвычайных ситуаций и поражения людей радиацией. Проблема разработки медицинских средств противорадиационной защиты в таких ситуациях приобретает всё большую актуальность [3]. Кроме того, в связи с расширением применения лучевой терапии в лечении онкологических больных актуальной остаётся проблема защиты тканей, находящихся в зоне лучевого воздействия [6]. Известно значительное число соединений, проявляющих противолучевую активность [2, 3]: средства профилактики радиационных поражений (цистамин, нафизин, препарат «Б-190»), средства стимуляции радиорезистентности организма (рибоксин, дезоксинат, поливитаминные и витаминно-аминокислотные комплексы), средства ранней и экстренной терапии радиационных поражений (беталейкин), средства профилактики и купирования первичной реакции на облучение (латран), средства лечения острого костномозгового синдрома (амбен, серотонина адипинат, лейкостим, молграммастим) и др. Но большинство радиопротекторов оказывают эффективное действие лишь при их применении в субтоксических дозах [2], что существенно затрудняет их применение.

Сейчас в области радиационной фармакологии значительно возрос интерес к препаратам природного происхождения, одним из которых является белок филаментов бактерий – флагеллин, мощный активатор врождённого и адаптивного иммунитета. Флагеллин является единственным известным естественным лигандом толл-подобных рецепторов5 типа (toll-like receptor – TLR-5), локализованных на поверхности многих клеток иммунной системы (дендритных, макрофагов, нейтрофилов, Т-клеток) и разных типов эпителиальных клеток [1, 8, 9, 11]. По данным зарубежной и отечественной литературы, имеется множество сообщений о высокой радиозащитной эффективности как полноразмерного белка флагеллина, так и его делетированных форм – рекомбинантного флагеллина (рФЛ) [1, 4]. Одним из перспективных направлений является разработка новых фармакологических средств противорадиационной защиты на основе флагеллина и его производных форм [7, 8, 10, 11].

Цель исследования. В экспериментах на облученных крысах изучить в динамике влияние рФЛ на течение и исходы острого радиационного поражения (ОРП), а также показатели периферической крови.

Материалы и методы. Исследование радиозащитного действия рФЛ проводили в опытах in viv o на 84 крысах – самцах массой тела 200–240 г, полученных из питомника Российской академии медицинских наук «Рапполово» (пос. Рапполово Ленинградской обл.). После поступления из питомника животные в течение 14 сут содержались в карантине, затем были рандомизированы по группам, включающим 12 особей, и до окончания опыта находились в одинаковых условиях содержания и кормления. Кормление животных проводилось 1 раз в сут в первой половине дня без ограничения доступа к воде. Все манипуляции осуществлялись с соблюдением правил биоэтики при работе с лабораторными животными [5]. Для моделирования ОРП лабораторных животных подвергали однократному относительно равномерному гамма-облучению на установке «ИГУР-1» в дозе 6 Гр, что соответствовало летальной дозе 50% животных за 30-суточный период наблюдения (ЛД50/30). Оценивали течение и исходы ОРП по влиянию на 30-суточную выживаемость и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) облучённых крыс. Для оценки влияния рФЛ на гемопоэз облученных животных на 3-и, 9-е, 14-е и 25-е сут после облучения у животных из хвостовой вены забирали периферическую кровь. Общеклинический анализ периферической крови проводили на гемоанализаторе «Abacus Junior». В работе использовали рФЛ, синтезированный с использованием гена FliC, кодирующего разновидность флагеллина бактерий Salmonella enterica serovar Typhimurium, синтезированный в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов [4]. Рекомбинантный флагеллин вводили подкожно, в утренние часы, за 15–30 мин до и 15–30 мин после облучения лабораторных животных.

Полученные данные подвергали статистической обработке с вычислением среднего значения показателя и его ошибки. Достоверность различий средних значений показателей выживаемости оценивали с использованием точного метода Фишера,показателей средней продолжительности жизни погибших от облучения животных – по непараметрическому логранк-критерию, количество лейкоцитов периферической крови – с помощью U-критерия Манна – Уитни.

Результаты и их обсуждение. Выявлено, что профилактическое введение рФЛ улучшает течение и исходы ОРП крыс. Так, при облучении крыс в дозе 6 Гр выживаемость животных контрольной группы к 30-м суткам составила 50±14%, а величина СПЖ – 23±3 сут. В случае профилактического введения рФЛ в дозе 100 мкг/кг выживаемость облученных крыс увеличивалась на 33%, а величина СПЖ на 5 сут и составила 83±11% и 28±2 сут соответственно. Введение рФЛ в дозировках 1 и 10 мкг/кг оказалось малоэффективным (табл. 1).

 

Таблица 1

Влияние профилактического введения рФЛ на течение и исходы ОРП у крыс облученных в дозе 6 Гр

Группа

Доза препарата, мкг/кг

Выживаемость,

%

СПЖ, сут

Контрольная

–

50±14

23±3

Получавшая рФЛ

1

50±14

23±3

Получавшая рФЛ

10

42±14

21±3

Получавшая рФЛ

100

83±11*

28±2

Примечание: * – различия по сравнению с контрольной группой, р≤0,05.

 

При введении рФЛ после облучения, радиозащитного действия препарата выявить не удалось. Так, в случае введения рФЛ в дозе 1 мкг/кг после облучения выживаемость составила 17±11%, а СПЖ составила 16±2 сут. Увеличение вводимой после облучения дозы рФЛ приводило к незначительному повышению выживаемости и СПЖ крыс. При введении рФЛ в дозе 10 и 100 мкг/кг выживаемость составила 33±14 и 50±14%, а СПЖ 21±2 и 22±3 сут соответственно (табл. 2).

Для изучения механизмов действия рФЛ исследовано его влияние на показатели периферической крови облучённых животных. У животных контрольной группы, облученных в дозе 6 Гр, в периферической крови отмечалась выраженная лейкопения. К 3-м сут после облучения отмечалось снижение уровня лейкоцитов до 5,1×109/л. По мере развития гематологического синдрома ОРП, лейкопения прогрессировала и к 9-м сут уровень лейкоцитов составил 3,2×109/л. На 14-е сут отмечалось постепенное восстановление пула лейкоцитов, при котором отмечалось увеличение показателя почти в 2 раза по сравнению с 9-ми сут, что составило 7×109/л. Восстановление уровня лейкоцитов дореферентных значений регистрировали к 25-м сут, когда их уровень составил 31×109/л.

Несколько иная картина наблюдалась при оценке показателей периферической крови у крыс, которым вводили рФЛ в дозе 100 мкг/кг до облучения. В этой группе животных, к 9-м сут после облучения уровень лейкоцитов составил 5,3×109/л, что на 40% больше по сравнению с группой контроля. К 14-м сут зафиксировано увеличение уровня лейкоцитов на 33% по сравнению с контрольной группой, что составило10,5×109/л. К 25-м сут в исследуемой группе отмечалась нормализация показателя до референтных значений, составившая 30,9×109/л, что существенно не отличалось от значения показателя в контрольной группе (рис.).

 

Рис. Уровень лейкоцитов в периферической крови крыс при профилактическом введении рФЛ в дозе 100 мкг/кг в разные сроки острого радиационного поражения

 

Все это свидетельствует о том, что введение рФЛ до облучения в дозе 100 мкг/кг оказывает защитное действие на кроветворные клетки и клетки костного мозга облученных крыс в дозе 6 Гр. Таким образом рФЛ оказывает выраженное радиозащитное действие у облученных крыс в условиях его профилактического применения в субтоксических дозах.

Полученные результаты подтверждают данные литературы о перспективности проведения дальнейших исследований, направленных на разработку флагеллинсодержащих средств химической защиты от лучевого поражения.

Выводы

  1. Рекомбинантный флагеллин оказывает выраженное радиозащитное действие при его введении лабораторным животным в дозе 100 мкг/кг подкожно за 15–30 мин до гамма-облучения в дозе 6 Гр. За 30-суточный период наблюдения рФЛ увеличивает выживаемость до 83% лабораторных животных при 50% гибели животных в контрольной группе.
  2. Введение рФЛ в дозе 1, 10, 100 мкг/кг подкожно, через 15–30 мин после облучения в дозе 6 Гр не оказывает радиозащитного эффекта. Применение рФЛ в дозе 1 и 10 мкг/кг усугубляет течение и исходы острого радиационного поражения. Так, в случае введения рФЛ в дозе 1 мкг/кг после облучения выживаемость составляет 17±11%, что на 33% ниже, чем в группе контроля.
  3. Профилактическое введение рФЛ в дозе 100 мкг/кг подкожно за 15–30 мин до облучения в дозе 6 Гр оказывает выраженное радиозащитное действие на кроветворные клетки и клетки костного мозга. Дозы рекомбинантного флагеллина ниже 100 мкг/кг при введении как до, так и после облучения не оказывают влияния на систему кроветворения облученных крыс в дозе 6 Гр.
×

Об авторах

Р. Ю. Сапожников

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Автор, ответственный за переписку.
Email: vestnikvmeda@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Ю. Ш. Халимов

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vestnikvmeda@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

В. И. Легеза

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vestnikvmeda@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Р. И. Литвиненко

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: vestnikvmeda@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

И. С. Драчев

Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины

Email: vestnikvmeda@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

C. Ю. Краев

Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины

Email: vestnikvmeda@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

А. С. Симбирцев

Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов

Email: vestnikvmeda@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Аль-Шехадат, Р.И. Получение и изучение свойств рекомби- нантного бактериального флагеллина / Р.И. Аль-Шехадат [и др.] // Хим. и биол. безопас. – 2012. – Спец. вып. – С.109–116.
  2. Васин, М.В. Классификация противолучевых средств как от- ражение современного состояния и перспективы развития радиационной фармакологии / М.В. Васин // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2013. – Т. 53, № 5. – С. 459–467.
  3. Владимиров, В.Г. О некоторых итогах и перспективах раз- вития профилактической радиационной фармакологии / В.Г. Владимиров, И.И. Красильников // Обзоры по клин. фармакол. и лек. терапии. – 2011. – Т. 9, № 1. – С. 44–50.
  4. Гребенюк, А.Н. Получение различных вариантов рекомбинант- ного флагеллина и оценка их радиозащитной эффектив- ности / А.Н. Гребенюк [и др.]. // Вестн. Росс. воен.-мед. акад. – 2013. – № 3 (43). – С. 75–80.
  5. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. – СПб.: Rus-LASA «НП объединение специ- алистов по работе с лабораторными животными», рабочая группа по переводам и изданию тематической литературы, – 2012. – 48 с.
  6. Иванов, В.К. Радиационные риски медицинского облучения / В.К. Иванов, А.Ф. Цыб, Ф.А. Метлер // Радиация и риск. – 2011. – Т. 20, № 2. – С. 17–29.
  7. Рождественский, Л.М. Проблемные вопросы разработки противолучевых средств / Л.М. Рождественский // Радиац. биол. Радиоэкол. – 2019. – Т. 59. № 2. – С. 117–126.
  8. Burdelya, L.G. An agonist of toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse and primate models / L.G. Burdelya [et al.] // Science. – 2008. – Vol. 320, № 5873. – Р. 226–230.
  9. Chen, H. Activation of Toll-like receptors by intestinal microflora reduces radiation-induced DNA damage in mice / H. Chen [et al.] // Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. – 2014. – Vol. 774. – P. 22–28.
  10. Honko, A.N. Effects of flagellin on innate and adaptive immunity / A.N. Honko, S.B. Mizel // Immunol. Res. – 2005. – Vol. 33, № 1. – Р. 83–101.
  11. Li, W. CBLB502, an agonist of Toll-like receptor 5, has antioxidant and scavenging free radicals activities in vitro / W. Li [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. – 2016. – Vol. 82. – P. 97–103.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. Уровень лейкоцитов в периферической крови крыс при профилактическом введении рФЛ в дозе 100 мкг/кг в разные сроки острого радиационного поражения

Скачать (40KB)
Метаданные

© , 2019


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 77762 от 10.02.2020.