Prostheses from the decellularized aorta and bioresorbable material in vivo

V. N. Alexandrov; Александров В. Н.; A. V. Kriventsov; Кривенцов А. В.; E. V. Mikhailovа; Михайлова Е. В.; M. A. Figurkina; Фигуркина М. А.; M. O. Sokolova; Соколова М. О.; V. E. Yudin; Юдин В. Е.; P. V. Popryadukhin; Попрядухин П. В.; G. G. Khubulava; Хубулава Г. Г.

doi:10.17816/brmma623251

Протезы из децеллюляризированной аорты и биорезорбируемого материала в эксперименте in vivo

Авторы: Александров В.Н.¹^,2, Кривенцов А.В.¹, Михайлова Е.В.²^,3, Фигуркина М.А.², Соколова М.О.², Юдин В.Е.⁴, Попрядухин П.В.⁴, Хубулава Г.Г.¹
Учреждения:
1. Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова
2. Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет
3. Институт цитологии Российской академии наук
4. Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук
Выпуск: Том 19, № 2 (2017)
Страницы: 120-125
Раздел: Экспериментальные исследования
URL: https://journals.eco-vector.com/1682-7392/article/view/623251
DOI: https://doi.org/10.17816/brmma623251
ID: 623251

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Современные сосудистые протезы подвержены тромбообразованию и развитию в них инфекций. В настоящее время ведется поиск схем антикоагулянтной, антибактериальной терапии и путей, исключающих использование подобных протезов. В этом контексте заслуживают внимание протезы из децеллюляризированного сосуда, то есть из внеклеточного матрикса, и протезы из биорезорбируемого материала, в частности полилактида: первые благодаря высокой вероятности эндогенной эндотелизации, индуцированной внеклеточным белковым матриксом, с последующим формированием аутогенного матрикса сосуда; вторые благодаря изначальной атромбогенности, пористости структуры, склонной к интеграции с сосудистой стенкой реципиента, эндотелизации, формированию матрикса и сосуда. Принципиальным является то, что такие протезы способны к росту и пригодны не только для взрослых, но и для детей с сердечно-сосудистыми дефектами. Однако результаты исследования данных протезов в динамике посттрансплантационного периода не соответствовали ожидаемым: протез из децеллюляризированной аорты оказался несостоятельным в пределах первых двух месяцев после трансплантации, а протез из биорезорбируемого материала, хотя достоверно переживал первый, но таил риск спонтанной несостоятельности, обусловленной предопределенной биорезорбцией и отсрочкой формирования внеклеточного матрикса. В этой связи было выдвинуто обоснованное предположение о возможной достаточности гибридного, биосинтетического протеза, включающего два слоя: внутренний из биорезорбируемого тромборезистентного материала и наружный из децеллюляризированного сосуда. Внутренний биорезорбируемый слой «снимет» проблему тромбоза, формирования аневризмы, а наружный из сосудистого матрикса обеспечит миграцию в протез клеток-предшественников эндотелиоцитов и миоцитов.

Ключевые слова

сосуд, внеклеточный матрикс, децеллюляризация, биорезорбция, протез, тромбоз, аневризма, эндотелиоциты, хемотаксис

Полный текст

Введение.

Известны сосудистые протезы из биологического материала (ауто-, аллои ксенопластического). Аутогенные протезы в 15–30% случаев имеют неустранимые недостатки (варикоз вен, атеросклероз артерий) и крайне неудовлетворительные результаты в отдаленном периоде, а использование аллои ксеногенных протезов невозможно без пожизненной иммуносупрессивной терапии [4]. Установка сосудистых протезов из синтетических материалов (вязаные, тканевые, плетеные) в 6–42% осложняется тромбозами и в 1,5–6% случаев инфекцией, сопровождающейся 75–100% летальностью [2]. Разработка протезов с внутренним антитромбогенным покрытием не решила проблем осложнений, возникающих в отдаленные сроки, так как атромбогенное покрытие уместно лишь в составе плотных (вязаных или плетеных) протезов, ограничивающих «вживление» протеза в ткани организма, провоцирующих отдаленные осложнения [5].

В этой связи заслуживают внимания биорезорбируемые материалы (БМ) на основе природных [1, 6, 20, 28] или синтетических [11, 25, 27] полимеров, используемых в тканевой инженерии в качестве матриц [24], поскольку они способны к интеграции с тканями реципиента, а также к эндотелизации как условию, необходимому для профилактики тромбоза, и формированию собственного матрикса. Эти материалы должны обладать не только биосовместимостью, отсутствием цитотоксичности как самих материалов, так и продуктов их резорбции [25, 26], то есть свойством, исключительным для пролиферации клеток в объеме матрицы и формирующейся ткани, идентичной ткани реципиента, и, наконец, необходимо наличие пор от десятков до сотен микрометров [19]. Для получения пористых полимерных материалов применяется ряд методик: облучение полимерных пленок высокоэнергетическими частицами, фазовое разделение растворов полимеров, введение различных порообразующих добавок [25]. В последнее время для получения материалов с размером пор 10–100 микрометров используют метод электроформирования нановолокон [8, 12]. В работах [6, 7] показано, что стромальные мезенхимные клетки хорошо закрепляются на поверхности материалов из нановолокон и при этом наблюдается высокая скорость их пролиферации.

Протезы, способные к «вживлению» в ткани реципиента, созданные на основе биорезорбируемых полимерных нанои микроволокон, обладают тромборезистентностью и рядом других необходимых качеств, предопределяющих возможность формирования в организме реципиента собственного внеклеточного матрикса с последующей резорбцией его синтетического эквивалента [6].

Использование в качестве протеза природной матрицы – децеллюляризированной аорты (ДА), то есть внеклеточного матрикса аорты, обеспечивает присущие матриксу функции, нацеленные на формирование естественного сосуда. Так, биологические полимеры, в него входящие, в частности белки, коллаген, эластин, протеогликаны, вместе с сохранившимися на матриксе после децеллюляризации аорты молекулами, регулирующими миграцию клеток из крови и окружающих тканей, их адгезию, пролиферацию и дифференцировку, способны к активной инициации процесса ремоделирования протеза (заселение клетками, синтез компонентов матрикса) с формированием естественного сосуда [9, 13, 14].

Эти обстоятельства позволяют рассматривать протезы из ДА и БМ как очередное поколение сосудистых протезов. Они в качестве сосудистых протезов позволят улучшить результаты реконструктивных операций, в том числе на сосудах малого диаметра, сводя к минимуму риск осложнений вследствие формирования естественного сосуда. Кроме того, использование таких протезов позволит отказаться от необходимости повторных реконструктивных операций вследствие их интеграции с тканями реципиента и ростом вместе с ростом пациента.

Цель исследования. Сравнительное исследование состояния протеза из ДА и БМ в эксперименте invivo в первый месяц после трансплантации.

Материалы и методы.

В работе использовали 30 самок крыс линии Вистар массой 250–300 г, из которых 10 животных – в качестве доноров аорты и 20 – в качестве реципиентов протезов[27]. Крыс содержали в соответствии с международными рекомендациями Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным.

Реципиентов разделили на 2 группы:

первой группе (n=10) вшивали протезы из БМ,
второй (n=10) – протезы из ДА.

Протезы кровеносных сосудов из БМ в виде трубчатых образцов диаметром 1,1±0,2 мм и толщиной стенки 320±10 мкм (рис. 1) получали путем электроформования на установке «NANON-01A» фирмы «MECCCo.»(Япония) в Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук в соответствии с оригинальной методикой [3] (рис. 1).

Рис. 1. Внешний вид протеза (а) и его стенки (б) из поли(L-лактида) для протезирования аорты крысы

15% раствор частично кристаллического полимера поли(L-лактида) в хлороформе под небольшим давлением пропускался через фильеру (металлическую иглу с внутренним диаметром 0,1 мм) в электрическом поле (напряжение 16 кВ) и попадал на вращающийся со скоростью 1500 об/мин цилиндр с внешним диаметром 1,1 мм. Расстояние между электродами (иглой и цилиндром) составляло 0,15 м. Для повышения механических характеристик и стабильности в биологической среде протезы из поли(L-лактида) подвергали термообработке в фиксированном состоянии (на цилиндре) при температуре 60°C в течение 1 ч.

Протез из ДА получали децеллюляризацией exvivo нативных аорт крыс-доноров. Деионизированной водой, 1% раствором тритона Х100, 0,5% раствором додецилсульфата натрия и 0,9% раствором натрия хлорида в описанной последовательности перфузировали аорты в течение 30 ч. Использовали роликовый насос «SK-BQ50» фирмы «Baoding Longer Precision Pump Co» (Китай) и канюлю № 22G. Раствор с объемной скоростью 1,4 мл/мин через канюлю поступал в аорту и, покидая ее, омывал адвентицию. Полученный протез оценивали на предмет отсутствия антигенного материала, прежде всего клеточного происхождения и герметичности.

Герметичность оценивали визуально при введении под давлением 0,9% раствора натрия хлорида в образец протеза, пережатого в дистальном отделе. Отсутствие остаточного клеточного материала определяли на гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином (световой микроскоп «Lab. A1» фирмы «CarlZeiss»(Германия). Присутствие остаточного количества дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) оценивали по наличию сигнала после окрашивания фрагмента ДА флуоресцентным красителем 4,6-диамидино-2-фенилиндол-дигидрохлоридом («DAPI» фирмы «ThermoFisher» (Соединенные Штаты Америки)) согласно протоколу производителя (конфокальный микроскоп «LSM710» фирмы «Carl Zeiss» (Германия)).

Перед трансплантацией протезы из ДА и БМ помещали на 30 мин в 70о этиловый спирт. Трансплантацию проводили в асептических условиях наркотизированным (золетил в дозировке 50 мг/кг и фентанил в дозировке 0,1–0,2 мл/кг) фиксированным на спине животным. Выполняли срединную лапаротомию ипод увеличением × 6 операционного микроскопа «OPMI PICO» фирмы «Carl Zeiss» (Германия) выделяли инфраренальный отдел аорты. После гепаринизации (100– 200 ед.) пережимали аорту и протезировали участок длиной 5 мм. Протез орошали оксациллином, рану послойно ушивали. Антикоагулянты не использовали.

Для оценки функциональной состоятельности протеза измеряли диаметр протеза и среднюю линейную скорость кровотока с помощью ультразвукового доплеровского исследования на диагностической ультразвуковой системе «Vivid i» фирмы «Siemens» (Германия). Исследовали зону проксимального, дистального анастомоза и середину протеза. В качестве контрольных данных использовали результаты аналогичных исследований интактных животных (n=5) такой же массы, пола и возраста.

Обследованных животных выводили из опыта летальной инъекцией тиопентала натрия (150 мг/кг). Invivo при 6 и 10-кратном увеличении микроскопа (×6 и ×10) оценивали состоятельность анастомозов, наличие деформаций протеза, изменение окружающей его ткани. Эксплантированные протезы вместе с прилежащей с проксимального и дистального конца протеза частью интактной аорты промывали 0,9% раствором натрия хлорида и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине для последующих исследований.

Данные представлены в виде среднего и 95% доверительного интервала. Сравнение 3 независимых выборок проводили с использованием непараметрического критерия Краскела–Уоллеса.

Результаты и их обсуждение.

Протез из ДА прочен, герметичен и соответствует требованиям иммунологической нейтральности [10]. Он не содержит остаточного клеточного и ядерного материала

–основной причины инициации иммунного ответа, что подтверждено сравнительным исследованием результатов оценки препаратов образцов интактной аорты и протезов, окрашенных гематоксилин-эозином и красителем DAPI (рис. 2).

Рис. 2. Отсутствие клеточного и ядерного материала во фрагменте децеллюляризированной аорты, подготовленной для трансплантации (а, в) по сравнению с нативной аортой крысы (б). Окраска гематоксилин-эозином (а, б). Показана сохранность внеклеточного матрикса по наличию аутофлуоресценции его компонентов (зеленый цвет) (в).Сигнал DAPI между белковыми слоями отсутствует: 1 – просветсосуда; 2 – tunicamedia; 3 – tunicaadventitia.

При полной утрате иммуногенности сохраняется целостность матрикса и его ламеллярная структура: слои коллагена и эластина четко дифференцируются по сигналу автофлуоресценции (рис. 2в), подтверждая оптимальный вариант протокола децеллюляризации.

Рис. 3. Трансплантированный протез из децеллюляризированной аорты (а) и биорезорбируемого материала (б). Ув. ×6

После имплантации протезов (рис. 3) ни у одного из животных экспериментальных групп на протяжении первых трех недель посттрансплантационного периода признаков ишемии задних конечностей не наблюдали: животные активно перемещались, кожные покровы лап были розовыми, теплыми и чистыми. При ультразвуковом исследовании диаметр протезов в группах животных одинаков (рис. 4а), однако линейная скорость кровотока у них же относительно контрольных снижена на 32% (р<0,05) (рис. 4б), возможно, изза меньшей толщины стенок протезов относительно стенки нативной аорты.

Рис. 4. Значения внутреннего диаметра протеза (а) и линейной скорости кровотока (б) в контрольной (К) и экспериментальных группах с протезами из биорезорбируемого материала (БМ) и децеллюляризированной аорты (ДА)

К концу наблюдения у одной из 10 крыс БМ группы развилась несостоятельность проксимального анастомоза с острой кровопотерей и гибелью животного. При вскрытии оставшихся 9 крыс патологии не выявлено. Брюшная полость чистая, анастомозы состоятельны, трансплантаты без патологии.

Рис. 5. Внешний вид протеза из биорезорбируемого материала через 1 мес после трансплантации

Интима протеза гладкая, блестящая, неотличима от интимы собственной аорты реципиента (рис. 5), признаков инфекционно-воспалительных изменений нет. В группе ДА гибели животных в установленный период наблюдения не было. Однако только у 4 из 10 животных отсутствовали видимые морфофункциональныеизменения. У остальных 6 крыс наблюдали развитие патологий, в дальнейшем, несомненно, вызвавших бы гибель: тромбоза (n=2, рис. 6а), аневризмы протеза (n=2, рис. 6б) и гиперплазии интимы со стенозом просвета до 50% (n=2, рис. 6в).

Рис. 6. Патологии, развивающиеся в течение 1 мес после трансплантации децеллюляризированной аорты: тромбоз (а), аневризма (б), стеноз (в)

При гистологическом исследовании материала образцов протезов, эксплантированных в рассматриваемые сроки, имела место не только полная реи эндотелизация (рис. 7), но и заселение клетками всей толщи протеза (рис. 8), но, видимо, недостаточная как по количественной, так и по качественной составляющей, фенотипу клеток для формирования естественного матрикса в рассматриваемое время.

Рис. 7. Рецеллюляризация протезов из биорезорбируемого материала (а, б) и децеллюляризированной аорты (в). Окраска гематоксилин-эозином. Стрелками отмечен сформировавшийся эндотелиальный слой: 1 – внутреннее пространство сосуда, 2 – протез. Масштабный отрезок – 50 мкм

Рис. 8. Рецеллюляризация в протезах из биорезорбируемого материала (а) и децеллюляризированной аорты (б). Сигнал от окрашенного DAPI ядерного материала (синий цвет) и автофлуоресценция (зеленый цвет). Масштабный отрезок – 50 мкм

Заключение.

Сосудистые протезы из децеллюляризированного нативного сосуда и биорезорбируемого материала по ряду признаков: тромборезистентности, биосовместимости, степени интеграции с тканями пациента – могут быть реальной альтернативой современным протезам при рассмотрении в ближайший послеоперационный период. Но нельзя исключить, что интеграция положительных свойств каждого из них в форме гибридного протеза, включившего тромборезистентный внутренний биорезорбируемый слой и природный наружный – децеллюляризированную аорту, позволит избежать описанных осложнений, лимитирующих формирование естественного сосуда.

Об авторах

В. Н. Александров

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова; Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: vnaleks9@yandex.ru
Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург