Методы селекции пробиотических микроорганизмов с высокими адгезивными свойствами

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

В Российском биотехнологическом университете ведётся работа по расширению коллекции промышленно-ценных микроорганизмов. Одним из важнейших направлений является селекция культур с пробиотическим потенциалом.

Пробиотики — препараты на основе живых микроорганизмов, предназначенные для коррекции аутохтонной микрофлоры человека и лечения ряда заболеваний.

Классификация пробиотиков включает три группы [1]:

1. Медицинские пробиотики — микробиологические препараты, в состав которых входят штаммы живых или инактивированных микроорганизмов. В данном случае речь идёт только о лекарственных препаратах, которые имеют чётко определённые показания к применению.
2. Пробиотики — биологически активные добавки — комплексные препараты на основе живых микроорганизмов, изготовленные на фармацевтических и иных предприятиях, которые используются в качестве биологически активных добавок к пище и, как правило, распространяются через аптечную сеть.
3. Алиментарные пробиотики — культуры микроорганизмов или обогащённые ими продукты, которые дополняют питание.

Селекция пробиотиков основывается на безопасности, функциональности и технологичности.

Требования к безопасности микроорганизмов, используемых в качестве пробиотиков:

• должны относиться к тем же видам, что и микроорганизмы — представители микрофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) здорового человека;
• должны быть непатогенными и нетоксигенными;
• не должны нести трансмиссивные гены антибиотикоустойчивости.

Селекция предпочтительных пробиотических микроорганизмов включает следующие функциональные свойства рассматриваемых культур (рис. 1):

• устойчивость к пищеварительным сокам, ферментам и желчи ЖКТ;
• адгезия на эпителии и приживление в пищеварительном тракте человека;
• иммуномодуляция и иммуностимуляция организма;
• оптимизация процессов обмена веществ;
• антагонизм к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам;
• антимутагенные свойства.

 

Рис. 1. Положительное влияние пробиотиков на здоровье человека [2]. / Fig. 1. Positive effect of probiotics on human health [2].

 

При селекции заквасочных и стартовых культур с пробиотическими свойствами, в том числе используемых в пищевой промышленности, должны учитываться такие технологические аспекты, как высокая степень выживаемости в технологическом процессе, антагонистическая активность по отношению к санитарно-показательной микрофлоре, стабильность в продуктах и жизнеспособность при хранении.

Селекция пробиотических микроорганизмов проводится в соответствии со следующей нормативной правовой документацией:

• Методические указания МУ 2.3.2.2789–10 «Продовольственное сырьё и пищевые продукты. Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов»;
• Методические указания МУК 4.2.2602–10 «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков»;
• ОФС.1.7.1.0008.15 «Пробиотики»;
• Методические указания МУК 4.2.1890–04 «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

В качестве пробиотиков, заквасочных и стартовых культур с пробиотическими свойствами в большинстве случаев используются молочнокислые бактерии. Лактобациллы — неспорообразующие, грамположительные, неподвижные, палочковидные бактерии, различающиеся по факультативным анаэробным процессам. Способны расти в анаэробной и аэробной среде, продуцируя молочную кислоту в виде конечного продукта ферментации [3]. Желудочно-кишечный тракт человека колонизирован несколькими видами Lactobacillus, включая L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. gasseri, L. johnsonii, L. paracasei [4, 5]. Некоторые лактобациллы были одобрены Продовольственной и сельскохозяйственной организацией ООН / Всемирной организацией здравоохранения как живые микроорганизмы, которые при введении в организм приносят пользу здоровью человека [6]. Именно это отличает живые микроорганизмы, непосредственно применяемые в качестве пробиотиков, от тех, которые используются при ферментации с целью получения пищевых продуктов.

Лактобациллы воздействуют на ЖКТ человека несколькими способами, например подавляют рост патогенных микроорганизмов за счёт способности к синтезу молочной, пропионовой и уксусной кислот. Накопление указанных органических кислот снижает pH среды, вследствие чего наблюдается подавление процесса роста и развития патогенных микроорганизмов [7–9]. Другой механизм — конкурентное предотвращение прикрепления патогенов к эпителию ЖКТ [10–14].

Микробиом кишечника является основным местом врождённого и приобретённого иммунитета [15–19]. Он покрыт слизью (муцином), которая содержит большую часть микробиоты и является местом адгезии пробиотических, условно-патогенных или патогенных микроорганизмов. Слизь представляет собой слой геля, необходимый для гидратации и смазки, а также как барьер против патогенных микроорганизмов и токсинов [20, 21, 10]. Он состоит в основном из воды, гликопротеинов, солей и липидов. Муцины представляют собой большие внеклеточные белки, которые сильно гликозилированы (около 80% солей и липидов) [22, 23]. Схема слизистой оболочки ЖКТ и муцина представлена на рис. 2.

 

Рис. 2. Схема слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и структура муцина [22]. / Fig. 2. The scheme of the mucous membrane of the gastrointestinal tract and the structure of mucin [22].

 

Белковые фрагменты муцинов обладают центральной гликозилированной областью, состоящей из повторов последовательности, богатых серином, треонином и пролином, N- и C-концевыми областями, а также содержат остатки цистеина и олигосахаридов [24–26].

Пробиотические бактерии играют потенциальную защитную роль против энтеропатогенов посредством различных механизмов, включая продукцию противомикробных соединений, снижение адгезии патогенных бактерий и конкуренцию за места связывания клеток-хозяев. Конкурентное вытеснение пробиотическими бактериями благотворно влияет не только на кишечник, но и на урогенитальный тракт и полость рта. Исследования in vitro с различными клеточными линиями кишечника широко использовались в последние десятилетия для оценки способности пробиотических бактерий к прилипанию и антагонизма к патогенам.

Адгезивность, т.е. прикрепление к эпителиальным клеткам ЖКТ, является одним из важных свойств пробиотических штаммов, поэтому определение адгезивных свойств считается необходимым этапом для исследования пробиотических микроорганизмов. Установлено, что адгезионная способность является штаммоспецифичным признаком, что следует учитывать при селекции пробиотических культур. В связи с этим требуется эффективной способ определения адгезивных свойств исследуемых пробиотических штаммов.

Целью данного исследования являлась разработка комплексного метода селекции высокоактивных пробиотических микроорганизмов, способных к пролиферации и дополнению аутохтонной микрофлоры кишечника индивида.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи.

1. Разработать схему отбора перспективных пробиотиков по уровню адгезивной активности штаммов, относящихся к наиболее часто используемым видам культур микроорганизмов в клинической практике.
2. Определить адгезивную активность пробиотических культур на эритроцитах крови.
3. Определить адгезивную активность пробиотических культур на клеточной линии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлись культуры молочнокислых бактерий и дрожжей, обладающих пробиотическим потенциалом, в том числе основные виды, используемые в пищевой промышленности и клинической практике: Lactococcus lactis, Lactiplantibacillus plantarum, Enterococcus faecium, Streptococcus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae var. boulardii.

Показатели пробиотических культур микроорганизмов, такие как степень адгезии, определяли согласно стандартным методикам, описанным в Методических указаниях МУК 4.2.2602–10 «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков».

При определении адгезивной активности молочнокислых бактерий на культурах клеток клеточную культуру выращивали на шестилуночном планшете в условиях 5% СО₂ до образования монослоя в течение 5–7 сут. Образовавшийся монослой клеток СаСо-2 инокулировали 1 мл бактериальной культуры определённой концентрации. После инокуляции культуры выдерживали в течение 1 ч при 37 °С, затем отмывали физраствором для удаления несвязанных бактериальных клеток. Снятие монослоя со связанными бактериальными клетками осуществлялось растворами Версена 0,02% и трипсина 0,25% в соотношении 3:1. Для подсчёта связанных бактериальных клеток использовали метод разведений при выращивании клеток на плотной питательной среде для выделения, подсчёта и культивирования лактобацилл (MRS).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Наиболее заметная точка взаимодействия между микроорганизмами и человеком находится на слизистых оболочках, что свидетельствует о том, что адгезия слизи является главной мишенью для контроля заселения пробиотиками. Методологии количественной оценки бактериальной адгезии к слизи заключается в количественном определении доли остаточных бактерий, связанных с функциональными слизистыми поверхностями после промывок. Количественная оценка остаточных бактерий может варьировать от простого подсчёта клеток до поверхностного плазмонного резонанса или атомно-силовой микроскопии. Наиболее распространённым методом количественной оценки адгезии слизи является использование флуоресцентного индикатора в качестве коррелята концентрации клеток. Поверхности часто модифицируют путём инкубации со слизью или путём культивирования кишечных эпителиальных клеток / тканей органа [27].

Однако данный метод является дорогостоящим и нецелесообразен к применению при первоначальном скрининге молочнокислых бактерий и дрожжей, обладающих пробиотическим потенциалом.

С целью определения пробиотического потенциала на начальном этапе было предложено провести скрининг молочнокислых бактерий и дрожжей по показателю степени адгезивности к клеткам эритроцитов. Указанный показатель отражает способность микроорганизмов пролиферировать в эпителии кишечника человека и животных, что позволяет микроорганизмам дополнять аутохтонную микрофлору кишечника конкретного индивида и повышает ценность данных культур при использовании их в клинической практике при лечении и профилактике различных заболеваний кишечника воспалительного характера. Отбор перспективных видов пробиотиков по уровню адгезивной активности вели по разработанной схеме (рис. 3).

 

Рис. 3. Схема отбора перспективных видов пробиотиков по уровню адгезивной активности штаммов. Примечание. СПА — средний показатель адгезии; КРС — крупный рогатый скот. / Fig. 3. Scheme of selection of promising types of probiotics according to the level of adhesive activity of strains. SPA — average adhesion index. Note: СПА — average adhesion index; КРС — large horned livestock.

 

Все исследуемые штаммы микроорганизмов включены в перечень микроорганизмов, разрешённых и предлагаемых к использованию в пищевой промышленности согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

При целенаправленном отборе штаммов молочнокислых бактерий и дрожжей для исследований использовали представителей наиболее популярных и перспективных пробиотических микроорганизмов: три штамма L. lactis № 65062, № 2523, № 2407 (б), по одному штамму L. plantarum № 2407, E. faecium № 6769, S. thermophilus № 2436, S. cerevisiae var. boulardii (препарат «Энтерол»).

Данные по адгезивной активности пробиотических культур, полученные в настоящих исследованиях, представлены на рис. 4.

 

Рис. 4. Степень адгезивности молочнокислых бактерий и дрожжей. / Fig. 4. The degree of adhesion of lactic acid bacteria and yeast.

 

По результатам штаммы L. lactis № 2407 (б) и L. plantarum № 2407 показали высокую степень адгезии — 5,0 и 5,1 соответственно, что является оптимальным при использовании пробиотических культур молочнокислых бактерий. Также необходимо отметить, что остальные используемые штаммы молочнокислых бактерий продемонстрировали средние показатели адгезии к клеткам эритроцитов крови барана, что подтверждает пробиотический потенциал указанных видов культур и соответствует требованиям нормативных правовых актов Российской Федерации.

ОБСУЖДЕНИЕ

Бактериальная адгезия к поверхности кишечника может быть первоначально обусловлена неспецифическим физическим связыванием в виде гидрофобных взаимодействий, за которыми следует вторая стадия адгезии с помощью специфических компонентов клеточной стенки. Присутствие некоторых поверхностных белков, таких как протеиназы, закреплённых в клеточной стенке, повышает гидрофобность и адгезивные свойства у молочнокислых бактерий. Белки, связывающиеся со слизью, содержащие домены Mub и (или) MucBP (MUCin связывающий белок), представляют собой поверхностно адгезивные белки, способные связывать муцин. Кроме того, адгезии могут способствовать фибрии и пили. Помимо указанных механизмов способствовать адгезии могут другие поверхностные белки, такие как фибропектин связывающие белки (fibronectin binding proteins, FBP) и белки поверхностного слоя (surface layer proteins, SLP).

Эта информация коррелирует с данными, полученными нами при исследовании: низкие показатели степени адгезивности, определённые у пробиотического штамма дрожжей S. cerevisiae var. boulardii, выделенного из препарата «Энтерол», — 1,9. Дрожжи имеют иной набор генов, поскольку не относятся не только к одному роду с молочнокислыми бактериями, но и даже к одному семейству.

Полученные результаты указывают на низкую способность штамма дрожжей прикрепляться к стенкам кишечника человека и животных, что свидетельствует о быстром прохождении дрожжевых клеток через ЖКТ и неспособности культуры штамма повлиять на состав аутохтонной микрофлоры человека и животных. Подобное свойство рассматривается производителем как непосредственное преимущество для использования препарата в клинической практике и пищевой промышленности.

Вместе с тем прилипание пробиотических бактерий оценивают in vitro с использованием муцина, адсорбированного на абиотических поверхностях, и канцерогенных клеточных линий человека, таких как CaСo-2 и HT-29, NCM460, чтобы имитировать адгезию к эпителиальным клеткам кишечника (IECs) [28, 29].

В Российском биотехнологическом университете разработан метод для определения адгезивных свойств бактерий с помощью линии клеток CaСo-2 (эпителиоподобные клетки аденокарциномы ободочной кишки человека) в монослое. Метод основан на взаимодействии бактерий с клеточной стенкой эпителиальных клеток колоноректальной карциномы кишечника человека СаСо-2 в монослое и подсчёте связавшихся бактерий с монослоем [30].

Адгезивные свойства микроорганизмов определяются по числу бактерий, связывающихся с 1000 клетками СаСо-2:

• от 1010 до 3000 бактериальных клеток — высокоадгезивный штамм;
• от 210 до 1000 бактериальных клеток — среднеадгезивный штамм;
• от 0 до 200 бактериальных клеток — низкоадгезивный штамм.

Метод был опробован на энтерококках, относящихся к лактобактериям. Результаты исследования показали, что с 1000 клетками СаСо-2 связывается 109×10³ клеток E. faecalis 55 (В-8652) и 27×10³ клеток E. thailandicus КПБ-2 (В-10984). Из этого следует, что штаммы характеризуются высокоадгезивными свойствами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведённые исследования позволили разработать последовательную схему скрининга пробиотических микроорганизмов, способных к активной пролиферации в кишечнике и, соответственно, к коррекции аутохтонной микрофлоры. При этом на начальном этапе возможно использование более дешёвых и доступных методов скрининга по показателю уровня адгезии к эритроцитам крови. Такие штаммы, как L. lactis № 2407 (б) и L. plantarum № 2407, E. faecium № 6769 продемонстрировали высокие значения указанного показателя, штамм пробиотических дрожжей S. cerevisiae var. boulardii продемонстрировал низкие значения. Для более детального определения адгезивных свойств молочнокислых бактерий и дрожжей возможно применение современных методик с помощью клеточных линий, включая эпителиоподобные клетки аденокарциномы ободочной кишки человека CaСo-2, которые в целом подтверждают высокоадгезивные свойства лактобактерий и возможность их применения в клинической практике.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Влад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: И.М. Чернуха — концептуализация, методология, руководство исследованием; Н.Г. Машенцева — ресурсы, создание рукописи и её редактирование, руководство исследованием, проведение исследования; М.С. Каночкина — методология, написание текста рукописи и редактирование, проведение исследования, визуализация; И.А. Фоменко — верификация и анализ данных, проведение исследования, написание рукописи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. I.M. Chernukha — conceptualization, methodology, research management; N.G. Mashentseva — resources, manuscript creation and editing, research management; M.S. Kanochkina — methodology, manuscript writing and editing, research, visualization; I.A. Fomenko — data verification and analysis, research, manuscript writing.

Об авторах

Мария Сергеевна Каночкина

Российский биотехнологический университет; Научно-исследовательская организация ООО «Микробные нутриенты иммунокорректоры»

Email: kanoch@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6077-5957
SPIN-код: 2584-6474

к.т.н.

Россия, 125080, Москва, Волоколамское ш., д. 11; Москва

Иван Андреевич Фоменко

Российский биотехнологический университет

Email: fomencoia@mgupp.ru
ORCID iD: 0000-0003-2478-1705
SPIN-код: 5861-2838

к.т.н.

Россия, 125080, Москва, Волоколамское ш., д. 11

Ирина Михайловна Чернуха

Федеральный научный центр пищевых систем имени В.М. Горбатова

Email: imcher@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-4298-0927
SPIN-код: 3423-3754

д.т.н.

Россия, Москва

Наталья Геннадьевна Машенцева

Российский биотехнологический университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: natali-mng@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9287-0585
SPIN-код: 9791-5806
Scopus Author ID: 57060483400
ResearcherId: R-8014-2016
https://mgupp.ru/obuchayushchimsya/instituty-i-kafedry/teacher.php?CODE=27797

д.т.н., профессор

Россия, 125080, Москва, Волоколамское ш., д. 11

Список литературы

Дополнительные файлы